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公开(公告)号
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CN1200103C
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公开(公告)日
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2005.05.04
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申请(专利)号
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CN02155222.3
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申请日期
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2000.06.23
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专利名称
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家禽用去势重组基因载体
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主分类号
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C12N15/13
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分类号
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C12N15/13;C12N15/11;C12N15/63;A61K31/7088;A61K39/00;A61P15/00;C12P19/34
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分案原申请号
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00107831.3
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优先权
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申请(专利权)人
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成都瑞盛高科技有限责任公司
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发明(设计)人
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吉传义;杜念兴;朱杰青;龚光明
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地址
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610041 四川省成都市高新区高朋东路3号21D
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颁证日
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国际申请
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进入国家日期
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专利代理机构
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北京路浩知识产权代理有限公司
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代理人
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钱宝英
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国省代码
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四川;51
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主权项
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家禽用去势重组基因载体，是通过以下方法构建获得的：1)LHRH基因片段的退火人工合成的家禽用去势疫苗基因片段L2：5′-GGCCATGGCTGAGCACTGGTCTTACGGCCTGCAGCCGGGTTAATGAACTCGAGCA-3′终止子XhoI将人工合成的家禽用去势疫苗基因片段的正链和负链，分别用灭菌超纯溶解成浓度为100pmol/l的溶液，各取2μl加入72μl超纯水中混匀，置沸水浴中2min后缓慢冷却至室温，-20℃冻存备用；2)LHRH基因的酶切用NcoI及XhoI对退火后的LHRH基因进行双酶切，酶切产物直接用于连接反应；3)pET-32c质粒的提取、酶切及回收pET--32c质粒的提取后，用NcoI及XhoI对PET-32c质粒进行双酶切；取10μl酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收酶切大片段，置液氮中冻5min，而后置37℃水浴融化，10000r/min离心10min，吸取上清-20℃冻存备用；4)连接DNA连接反应体系如下：PET-32c双酶切回收产物2.5μlLHRH基因酶切产物7.5μlDNALigationKitSolutionI10μl上述混合物16℃反应30min后立即用于转化；5)大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备；6)转化取10μl连接产物转化200μlDH5α感受态细胞，取200μl转化产物涂布含Amp50μg/ml的LB琼脂平板，平板置37℃温箱中培养18小时，挑取转化后的单个菌落，接种含Amp的LB肉汤扩大培养后提取质粒，即为重组质粒。
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摘要
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本发明家禽用去势重组基因载体，用于生产家畜家禽去势基因工程亚单位疫苗，属于生物技术高科技领域。其方法如下：人工合成畜用、禽用或畜禽通用的LHRH基因片段，其5′端和3′端分别加有NcoI和XhoI酶切位点，插入pET-32c质粒，构建成4种表达LHRH-Trx融合蛋白的pET-32c LHRHn-N/X重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，表达产物为可溶性蛋白，便于提取纯化，家畜、家禽通用，免疫鸡、猪、羊、兔、犬、猫等动物，可有效去势。图为重组质粒pET-32c LHRHn(L1、L2、L3、L4)-N/X的构建。
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国际公布
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