| 公开(公告)号 | CN1693480A |
| 公开(公告)日 | 2005.11.09 |
| 申请(专利)号 | CN200510049601.2 |
| 申请日期 | 2005.04.20 |
| 专利名称 | 实时定量PCR技术检测人21号染色体数目的方法 |
| 主分类号 | C12Q1/68 |
| 分类号 | C12Q1/68 |
| 分案原申请号 | |
| 优先权 | |
| 申请(专利权)人 | 浙江大学医学院附属妇产科医院 |
| 发明(设计)人 | 吕时铭;朱宇宁;裘 俭;朱 波;尤建飞 |
| 地址 | 310006浙江省杭州市学士路2号 |
| 颁证日 | |
| 国际申请 | |
| 进入国家日期 | |
| 专利代理机构 | 杭州求是专利事务所有限公司 |
| 代理人 | 张法高;赵杭丽 |
| 国省代码 | 浙江;33 |
| 主权项 | 检测人21号染色体数目的方法，其特征是：通过应用基因组特异性单拷贝序列作为染色体的分子标记，在21号染色体的唐氏综合征关键区域选择DSCR4基因的部分非多态性片段为目标分子标记，在1号染色体上不易发生缺失或三体的区域选择RABIF基因的部分片段为内参分子标记，分别设计两对引物及相应的Taqman探针，采用多重实时定量PCR技术对目标分子标记和内参分子标记进行同管扩增，通过deltact值来确定21号染色体数目并由此诊断21三体综合征，通过以下步骤实现：(1)选择染色体的分子标记21号染色体上的目标分子标记为GTTGATGGGCTTGCGCTTATCTGCTTGTCCCTTCTCCCATCTGATTTCTTGTGGAGCCCATGG其中上游引物序列：5’-GTTGATGGGCTTGCGCTTAT-3’下游引物序列：5’-CCATGGGCTCCACAAGAAAT-3’Taqman探针序列：5’-Fam-TGCTTGTCCCTTCTCCCATCT-Tamra-3’1号染色体上的内参分子标记为TCAACATGGGCCCCACATGGTCCTAGTTTCCCCGGCTCATTATGCTTCAGGCACACTGGCTTTCTTGC其中上游引物序列：5’-TCAACATGGGCCCCACAT-3’下游引物序列：5’-GCCAGTGTGCCTGAAGCA-3’Taqman探针序列：5’-Vic-TCCTAGTTTCCCCGGCTCATT-Tamra-3’(2)标本制备取新鲜EDTA抗凝全血或羊水，采用QIAampDNABloodMiniKit提取DNA，用紫外分光光度计检测DNA纯度及浓度；(3)多重实时定量PCR扩增采用ABIPrism7000型荧光定量PCR仪同管扩增目标分子标记及内参分子标记，反应体系25μl，含基因组500-25000拷贝，加入两对引物各500nM，相应Taqman探针200nM，dNTP100μM，Mg+3.5mM，Taq酶5U，ROX200nM，反应条件为95℃5分钟预变性；95℃30秒，60℃30秒，两步法40个循环；(4)定量分析采用ABIPrism7000型荧光定量PCR仪随机附带软件进行定量分析，分析体系设置为0.14，基线范围起点为第6个循环，终点为同板反应最小ct值的前1-3个循环，软件自动输出各扩增片段的ct值，计算deltact值，根据不同的deltact范围来判断21号染色体数目。 |
| 摘要 | 本发明提供检测人21号染色体数目的方法，是应用基因组特异性单拷贝序列作为染色体的分子标记，在21号染色体的唐氏综合征关键区域选择DSCR4基因的部分非多态性片段为目标分子标记，在1号染色体上不易发生缺失或三体的区域选择RABIF基因的部分片段为内参分子标记。设计两对引物及相应的Taqman探针，采用多重实时定量PCR技术同管扩增这两个序列，通过反映相对量的delta ct值来确定21号染色体的数目并由此诊断21三体综合征。本发明将染色体的数目分析转化为分子信号检测，充分利用分子定量的优势，不仅方法简便、高度敏感、稳定和检测率高，而且还具有高通量和自动化的特点，在临床有极好的应用前景。 |
| 国际公布 |
