| 公开(公告)号 | CN1296479C |
| 公开(公告)日 | 2007.01.24 |
| 申请(专利)号 | CN200510044143.3 |
| 申请日期 | 2005.07.27 |
| 专利名称 | 一种人角膜内皮细胞系的构建方法 |
| 主分类号 | C12N5/08(2006.01)I |
| 分类号 | C12N5/08(2006.01)I |
| 分案原申请号 | |
| 优先权 | |
| 申请(专利权)人 | 中国海洋大学 |
| 发明(设计)人 | 樊廷俊;付永锋;丛日山;汤志宏;孙文杰;于秋涛;王 晶;赵 君 |
| 地址 | 266003山东省青岛市市南区鱼山路5号 |
| 颁证日 | |
| 国际申请 | |
| 进入国家日期 | |
| 专利代理机构 | 青岛海昊知识产权事务所有限公司 |
| 代理人 | 张中南 |
| 国省代码 | 山东;37 |
| 主权项 | 一种人角膜内皮细胞系的构建方法，首先从眼库中取出人角膜，分别用氯化汞溶液和庆大霉素消毒后置于超净工作台中，将角膜的凹面朝上平放于玻璃培养皿中，向凹陷区加入0.2～0.5％胰蛋白酶溶液0.5～1毫升消化3～6分钟后；再把角膜平均剪成4片，按内皮面朝下的方向贴入24孔培养板的孔底，加入含有20％胎牛血清的DMEM/F12培养液，置于5％二氧化碳培养箱中、37℃进行贴板培养，并以时间梯度连续揭膜的培养方法将获得的人角膜内皮细胞，上述时间梯度连续揭膜的培养方法是将角膜片培养24～48小时后，取出角膜片转贴于另一新培养孔中，加入同样培养液继续培养；于培养箱中12～24小时后，取出角膜片再转贴于另一新培养孔中，再加入同样培养液继续培养；6～12小时后，取出角膜片，于倒置光学显微镜下挑选出只含有人角膜内皮细胞的培养孔中的角膜内皮细胞，于培养箱中放置12～24小时后，在每个培养孔中加入1毫升的人角膜内皮细胞专用培养液——DMEM/F12培养液，20％胎牛血清，0.25‰～1‰硫酸软骨素，0.05‰～0.15‰羧甲基壳多糖，然后置5％二氧化碳培养箱中于37℃培养；每间隔3～5天更换人角膜内皮细胞专用培养液1次，待人角膜内皮细胞长成单层后，用0.2～0.5％胰蛋白酶溶液消化制成细胞悬液，按1瓶传2瓶的方式进行传代培养；待人角膜内皮细胞再次长成单层后，仍以相同方法进行传代。 |
| 摘要 | 一种人角膜内皮细胞系的构建方法，它是以角膜内皮为材料，先将角膜内皮面朝下进行贴板培养，采用时间梯度连续贴膜法获得纯净角膜内皮细胞，在含20％胎牛血清、硫酸软骨素氧化降解物、表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、牛眼生素的DMEM/F12培养液中培养；采用胰蛋白酶消化法进行传代培养。该技术工艺科学合理，经这种方法所获得的传代细胞目前已传至第106代。本发明的角膜内皮细胞未经任何病毒或癌基因转染，因此获得的人角膜内皮细胞没有任何致瘤性，可望直接用于人工角膜生产和临床应用。 |
| 国际公布 |
