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1 材料和方法
1.1 实验动物 实验动物为C57BL/6j雌鼠和BALB/c雄鼠，小鼠购自中国科学院国家啮齿动物研究中心上海分中心上海斯莱克斯有限公司。供体为8～10周龄C57BL/6j雌鼠和10～12周龄BALB/c雄鼠杂交的F1代第1天小鼠卵巢，受体为F1代8～12周雄鼠。
1.2 主要试剂与设备 丹参注射液（正大青春宝药业有限公司生产，批号Z33020177)；Leibovitz-15、胎牛血清、DMSO（Sigma公司)；兔抗增殖细胞核抗原（PCNA)多克隆抗体、SP免疫组化试剂盒（北京博奥森生物技术有限公司 )；反转录试剂盒（TAKARA)；KRYO10-22seriesⅢ程序冷冻仪(英国Planer公司)；ThemoHybaid PCR仪(英国TECHNE公司)。
1.3 实验方法
1.3.1 卵巢的收集，低温保存和解冻：断颈处死1日龄受体雌鼠，体视显微镜下分离卵巢，放入L15液中，去掉卵巢周围的包膜，卵巢转移至冷冻液（L-15、10% FBS和1.5 mol/L DMSO)中，再把10～12枚卵巢转移至0.25 mL的塑料麦管中，并用聚乙烯氯化物粉末密封细管。采用Gosden的慢冻方法进行冷冻，最后投入液氮保存。卵巢移植时把冷冻保存1周至6个月的卵巢麦管从液氮中取出，在空气中放置20 s，然后快速投到室温水中10～20 s，取出卵巢转移至L15(含10% FBS)液中。在L15液(含10% FBS)中多次漂洗以去除其中的抗冻剂。
1.3.2 卵巢移植：8～12周龄的雄鼠作为受体，麻醉后背部切开显露双侧肾脏，用锐利镊在肾囊上撕开一个洞，把解冻的卵巢塞入到肾囊中，每侧一个。
1.3.3 实验分组与移植卵巢回收：将受体小鼠按给药不同分为两组：对照组和丹参组，各40只，分别于移植前1 d至回收当日每天腹腔注射0.5 mL生理盐水和0.5 mL(含0.15 g)丹参注射液。于移植后1 d、2 d和14 d三时间段回收。各时间段小鼠卵巢放入RNA-latter液中用于SOD mRNA及iNOS mRNA的RT-PCR半定量测定，同时移植后14 d回收移植物固定、石蜡包埋用来做HE染色及PCNA免疫组化分析。实验中另取移植后14 d大B6C2F1雌性小鼠新鲜卵巢10个固定包埋作为卵巢卵泡计数的新鲜组。
1.4 观察指标与方法
1.4.1 组织学检查和全卵巢卵泡计数：移植后14 d回收和14 d新鲜卵巢，在Bouin’s液中固定过夜，石蜡包埋后5μm连续切片进行HE染色，高倍镜（×400)下进行卵泡计数。卵泡分类如下：①单层扁平颗粒细胞围绕卵母细胞的为原始卵泡。②单层立方颗粒细胞围绕卵母细胞的为初级卵泡。③两层或以上立方颗粒细胞围绕卵母细胞，无窦腔的为次级卵泡。④两层以上颗粒细胞，卵泡内有窦腔形成为窦卵泡。为避免卵泡重复计数，只计数有卵母细胞核的卵泡。各组卵泡总数与新鲜组卵巢卵泡总数的比为卵泡存活率医.学.全.在.线www.med126.com。
1.4.2 PCNA免疫组化分析：移植后14 d回收的卵巢组织常规固定包埋，5μm连续切片每隔10张切片取一张按试剂盒说明进行免疫组化染色，苏木素复染。结果判断：阳性呈棕褐色定位于细胞核内，阴性细胞核呈蓝色。每张切片在200倍视野下计数5个视野，每个视野计数200个以上细胞中染色阳性的细胞数，计算阳性指数（阳性指数%=视野内的阳性细胞数/视野内总细胞数×100%)。
1.4.3 RT-PCR检测SOD mRNA、iNOS mRNA表达：用Trizol一步法提取总RNA。M-MuLV逆转录酶及Oligo(dT)18 primer 逆转录成单链cDNA。测定SOD mRNA、iNOS mRNA以及actin mRNA含量，引物见表1。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析，通过凝胶扫描和Quantity One电泳成像分析软件进行条带分析，将目的基因与内参β-actin mRNA条带的比值作为目的基因mRNA水平的参数。
1.5 统计学处理方法 卵泡计数的比较采用单因素方差分析，两组间SOD mRNA和iNOS mRNA基因表达采用两样本的t检验分析。
2 结果
2.1 全卵巢卵泡计数 移植后14 d新鲜卵巢组(见图1a)中原始卵泡成簇排列，明显多于对照组（见图1b)和丹参组（见图1c)。移植后14 d回收全卵巢卵泡计数丹参组多于对照组，且原始卵泡、初级卵泡、窦前卵泡及窦卵泡各级卵泡数均多于对照组，差异存在显著性（P <0.05)。卵泡存活率丹参组（64.1%)显著高于对照组（44.7%)，两移植组均比移植后14 d新鲜组卵泡数显著减少。详见表2。
2.2 PCNA免疫组化结果 阳性呈棕褐色，定位于初级卵泡和次级卵泡的颗粒细胞和卵细胞核内，阴性细胞核呈蓝色。对照组阳性率为85%～90%，丹参组为80%～85%，两组差异无显著性。见图2。
2.3 SOD mRNA和iNOS mRNA的基因表达 SOD mRNA的表达在移植后的三个时间段，丹参组均明显高于对照组（P<0.01)，卵巢移植后的各时间段均有iNOS mRNA的表达，在对照组中，第1天iNOS mRNA开始升高，第2天达到最高值，第14天有所下降，与对照组相比，丹参组的iNOS表达降低，两组差异存在显著性（P<0.05)，见表3、图3。
