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1.2 细胞株
HeLa细胞(人宫颈癌细胞)由华中科技大学附属协和医院王泽华教授惠赠。
1.3 细胞培养
培养于37 ℃，5% CO2细胞培养箱。DMEM培养基(含10%新生牛血清)培养,取对数生长期细胞待用。
1.4 细胞生长抑制实验
采用噻唑蓝(MTT)还原法:取对数生长期细胞,96孔培养板中接种细胞,每孔加含4 000个细胞的培养基200 μL,培养24 h后,吸尽培养基，以无血清培养基加TCS,使终浓度分别为10、20、40、80、160 mg/L。以有细胞不含药物的培养基为对照组，以无细胞的培养基为空白对照，每个浓度及对照均设4个复孔，分别培养24、48和72 h后,加MTT,在37 ℃培养4 h后，吸出上清液，每孔加150 μL DMSO,将培养板置于微孔板振荡器上振荡10 min，在酶标仪上检测570 nm波长处光密度值(OD值)。将各测试孔的OD值减去本底(空白对照组)OD值，各复孔的OD值取(均数±标准差)。按公式细胞抑制率(%)=(1-实验组平均OD值/对照组平均OD值)×100%，计算药物对细胞生长的抑制作用。
1.5 细胞周期观察及凋亡检测
取不同浓度TCS(20、40和80 mg/L)分别作用对数生长期HeLa细胞48 h后,收集细胞，按凯基PI染料试剂盒操作说明收集处理细胞，流式细胞仪测定荧光强度,激发波长488 nm,采用Modfit分析软件进行细胞周期DNA含量分析及细胞凋亡率检测。
1.6 组织基因组DNA提取和DNA亚硫酸氢盐处理
按照组织基因组DNA提取试剂盒的说明提取HeLa细胞的基因组DNA，甲基化试剂盒的说明行DNA变性和亚硫酸氢盐转化，修饰后的DNA-20 ℃保存待用。
1.7 MSP(甲基化特异性PCR,methylation-specific PCR)
APC基因启动子甲基化检测采用MSP法，当APC基因启动子甲基化则甲基化引物有PCR产物;反之，则非甲基化引物有PCR产物。APC基因启动子区CpG岛甲基化引物：上游引物：5′-GGTATATTTTCGAGGGGTACG-3′，下游引物：5′-TTCCCGACCCGCACTCCGC-3′，产物长度90 bp;非甲基化引物：上游引物：5′-TGTGAGGGTATATTTTTGAGGGGTAT-3′，下游引物5′-CTTCTCTCTCCACTTCCCAACCCA-3′，产物长度109 bp[2]。每50 μL PCR反应体系包括：50 ng修饰后的DNA，5×PCR缓冲液10 μL，上下游引物各20 pmol， Taq DNA聚合酶1.25 u，10 mM dNTP Mix1 μL。PCR条件:95 ℃预变性5 min,95 ℃变性60 s,55 ℃退火60 s,72 ℃延伸60 s,循环38次,72 ℃再延伸4 min。PCR产物采用2%的琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察并成像。
1.8 统计学处理
计量资料用x±s表示,采用SPSS 14.0统计软件。药物浓度与抑制率关系用线性回归分析，方差分析检验。细胞周期与凋亡率组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD和SNK检验(方差齐)医.学全.在.线网站www.med126.com。
2 结果
2.1 TCS对HeLa细胞生长的抑制作用
TCS对HeLa细胞的生长具有明显的抑制作用(见表1)。同一时间下，随着TCS浓度增大，抑制率显著增大(P<0.01)。采用线性相关分析同一时间下浓度与抑制率的相关性，24 h回归方程为Y=0.187+0.002X[Y为抑制率，X为TCS浓度(单位mg/L)]，决定系数R2 =0.965，P=0.003。48 h回归方程为Y=0.331+0.002X，R2 =0.945，P=0.006。72 h回归方程Y=0.378+0.003X，R2=0.965，P=0.002。
表1 不同浓度TCS对HeLa细胞增殖的抑制率(略)
2.2 TCS对HeLa细胞周期的影响
分析TCS作用HeLa细胞48 h后细胞周期的变化(见表2)，HeLa细胞在20 mg/L TCS作用后G1/G0期细胞百分比与对照组比较无显著差异(P>0.05),40 mg/L、80 mg/L组与对照组比较降低(P<0.01)，三种浓度间比较有显著差异(P<0.01)。三种浓度S期细胞百分比较对照组增高(P<0.01),三种浓度间比较有显著差异(P<0.01)。三种浓度G2/M期细胞百分比较对照组均降低(20 mg/L，P<0.05;40 mg/L、80 mg/L，P<0.01)，三种浓度组间差异有统计学意义(P<0.05)。
2.3 TCS对HeLa细胞凋亡率的影响
分析TCS作用HeLa细胞48 h后细胞凋亡率的变化(见表2)，三种TCS浓度作用后分别与对照组比较细胞凋亡率显著增高(P<0.01)。三种浓度之间比较亦有显著差异(P<0.01)。
2.4 TCS对HeLa细胞APC基因启动子甲基化状态影响
TCS处理前HeLa细胞APC基因启动子甲基化和非甲基化产物均为阳性,见图1。20、40 mg/L TCS处理细胞48 h，APC基因启动子甲基化状态未改变。80 mg/L TCS处理HeLa细胞48 h后，APC基因非甲基化产物有PCR扩增条带，而APC基因甲基化产物无扩增条带。
表2 不同浓度TCS对HeLa细胞周期及凋亡率的影响(n=3)(略)
注：与对照组比较,^P<0.05，△P<0.01。
图1 TCS处理前后HeLa细胞APC基因甲基化状态(略)
