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紧密连接蛋白claudin-6通过p38 MAPK途径诱导乳腺癌细胞MCF-7凋亡
紧密连接是内皮和上皮细胞之间重要的连接形式，对于维持细胞极性和通透性方面发挥着重要作用。Claudins是构成紧密连接的一种重要的跨膜蛋白。近年的研究表明，紧密连接参与了细胞信号转导过程调节了细胞的增殖和凋亡。Claudin蛋白通过胞浆区的羧基末端的PDZ结合序列与细胞骨架蛋白或信号蛋白相结合调节细胞的生理活动。Claudin-6为claudin蛋白家族成员之一。
我们在前期工作中发现，与对照相比稳定过表达claudin-6的MCF-7细胞生长缓慢，且流式细胞术检测细胞存在着一定的死亡，为证实这种死亡部分是由凋亡造成的，我们检测了转染claudin-6前后细胞的凋亡及凋亡相关基因的表达情况，本论文初步探讨了claudin-6在MCF-7细胞凋亡中的作用。
1 材料和方法
1.1 材料 稳定过表达claudin-6的MCF-7细胞为本室保存。原位检测细胞凋亡的TUNEL试剂盒和DAPI染料购自德国Roche公司。Annexin- /PI apoptosis Ⅴ 试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。 TRIZOL reagent和RT-PCR试剂盒为TaKaRa公司产品。 Dulbeccos modified Eagles medium (DMEM) 高糖培养基、胎牛血清和G418均为Gibco 公司产品。抗人磷酸化p38抗体购自Cell SignalingTechnology。信号转导通路抑制剂SB203580购自Calbiochem公司。
1.2 方法
1.2.1 实验分组：以下实验均分为三组，对照组（control)为未转染的MCF-7细胞；空载组（vector)为转染空载体的MCF-7细胞；实验组为稳定表达claudin-6的MCF-7细胞组（C1-C2) 。所有实验至少重复三次。
1.2.2 TUNEL法检测细胞凋亡 按TUNEL试剂盒说明进行：取细胞爬片，用胃蛋白酶37℃消化 60min；PBS 冲洗，加 50μl 的0.3％H2O2 甲醇溶液，PBS冲洗；加 25μl 的 TUNEL 反应溶液，37℃孵育60min；PBS 冲洗，加 25μl 的辣根过氧化物酶抗体，湿盒中 37℃孵育60min；PBS 冲洗，加一滴新鲜配制的DAB 室温孵育10min，PBS 冲洗；苏木精复染核，酒精脱水，干燥；中性树胶封片，光镜观察，细胞核棕色者为阳性。
1.2.3 Annexin- /PI Ⅴ 双染法检测细胞凋亡 按试剂盒说明书操作：常规胰酶消化细胞并计数，调整细胞浓度至 5×105-1×106个/ml。取 1ml细胞 1000rpm，4℃离心 10min 后弃上清。加入1ml冷的PBS，轻轻震荡使细胞悬浮， 1000rpm， 4℃离心 10min 后弃上清。将细胞重悬于200ul Binding Buffer，加入10ul AnnexinV-FITC和 5ul PI，轻轻混匀，避光室温反应 15min 或 4℃反应30min后将染色后的细胞悬液加入 96 孔板中，在 1h 内用荧光显微镜检测。阳性结果判断：绿色为早期凋亡细胞，红色为晚期凋亡细胞。
