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4 讨论
先天性小耳畸形是由于胚胎时期第一鳃沟及其邻近的第一、 二鳃弓的发育异常引起的一组颌面畸形，其病因尚不明确，环境和遗传是重要发病因素，主要表现为外、中耳异常，传导性或混合性耳聋，多伴有耳前凹、耳前赘或副耳。小耳畸形同时伴耳前凹、耳前赘等符合鳃-耳综合征（Panchio-oto syndrome, BO)的诊断标准，BO 的个体具有与鳃-耳-肾综合征（Panchio-oto-renal syndrome，BOR)相同的鳃耳畸形，只是缺少肾脏异常。因此，我们考虑先天性小耳畸形可能属于 BO/BOR 疾病谱。本研究选择的先天性小耳畸形患者，除不具有鳃裂瘘管的症状外，其余症状均符合BOS。人类中EYA1基因发生突变或表达异常可导致BO/BOR。EYA1基因编码的蛋白质对鳃弓和耳部的正常发育至关重要，EYA1基因敲除小鼠具有外、中耳异常及传导聋的症状。本实验对先天性小耳畸形伴耳前凹、耳前赘患者进行EYA1基因突变检测，但未发现EYA1基因突变位点，仅检测到4 种单核苷酸多态，考虑EYA1基因突变可能不是中国人群先天小耳畸形的主要致病原因。
表观遗传是环境因素与细胞的遗传物质交互作用的结果， 表观遗传学的研究为揭示先天性小耳畸形发病机制提供了新的思路。表观遗传学是研究没有DNA 序列变化的、可遗传的表达改变, 其分子机制目前研究最深入的是甲基化形式的遗传。 DNA甲基化便是其中一个为人所熟知的基因外遗传信号，是指在DNA甲基转移酶的作用下，以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，将甲基基团转移到胞嘧啶和鸟嘌呤二核苷酸(CpG)的胞嘧啶上。CpG 相对集中的区域称为 CpG 岛，CpG 岛存在于组织特异基因或者管家基因中，大约50 %的人类基因中含有CpG 岛，常位于基因上游调控区的启动子区。DNA的甲基化状态改变作为一个表观的标签，易于受激素、饮食以及药物等外界因素的可逆的修饰，标示出该基因是沉默或表达。当甲基化程度越高，基因就越沉默，反之亦然，即基因转录水平与其甲基化水平呈负相关。在肿瘤疾病中 DNA 甲基化改变表现为整个基因组 DNA 低甲基化、局部基因高甲基化。与肿瘤的过度增生相反，先天性小耳畸形属发育不良性疾病，其DNA甲基化情况是否存在相应的改变呢？我们选择EYA1基因为候选基因，在先天性小耳畸形患者中检测该基因启动子区域甲基化状态，结果显示 EYA1 基因启动子区域 CpGUnit_3 和 CpGUnit_5 甲基化程度显著性低于正常对照，其差异具有统计学意义。提示局部基因可能存在低甲基化状态，整个基因组 DNA及其他候选基因甲基化情况还有待下一步研究。
目前使用的大多数甲基化检测方法都是以亚硫酸氢盐预处理法使胞嘧啶转变为尿嘧啶为基础的。预处理后，对于基因上核苷酸的变化检测方法很多，但工作量巨大。以芯片技术为基础的 MALDI-TOF质谱分析技术具有高灵敏度和准确度、分析速度快、测量范围宽、分辨率强、小样品等优点，实现了高通量的DNA甲基化检测。我们应用此技术对先天性小耳畸形患者 EYA1 基因启动子区域甲基化状态进行了检测，结果显示该区域 CpGUnit_3 和CpGUnit_5 甲基化程度显著性低于正常对照，这表明 CpG 岛中每个位点的甲基化率并不均一,可能在抑制基因转录上的作用也不同，这也同近期其他研究结果相吻合。此技术的缺点是要求检测的扩增片段为200~600bp大小，因而本研究中的Unit8和 Unit9因为分子量太小就未能检测。CpGUnit_3 和CpGUnit_5 两位点低甲基化改变， 我们推测其可能与先天性小耳畸形发病相关，可能的机制为：第一，EYA1 基因具有基因剂量效应，达到一定阈值才能发挥正常功能医.学全.在.线网站www.med126.com。这种阈值效应可以解释不同患者之间存在表型差异，即使在同一家系中也存在外显不全和表现度变异。EYA1 基因低甲基化会导致转录和翻译过程的异常开放，干扰了相关发育基因的调控过程。第二，EYA1 基因低甲基化也可能引起患侧组织染色体重构，并进而导致细胞表型的变化，这也可能是许多BO未能检测到 EYA1 基因突变，但观测到染色体复杂重组的原因。其临床意义尚需研究 EYA1 基因 CpGUnit_3 和 CpGUnit_5 两位点低甲基化改变对基因表达及耳软骨细胞生物学特性的影响进一步予以证实。
