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临床医学论文先天性小耳畸形的发病机制
EYA1(eyes absent 1)基因是 EYA家族中的一个重要成员，EYA 家族因其特有的C端编码 271 个氨基酸的保守性较高的EYA结构域(Eya Domain ED)而得名。EYA1基因编码的蛋白质对鳃弓和耳部的正常发育至关重要，且具有基因剂量效应，需要达到一定阈值才能发挥正常功能。 人类中 EYA1基因发生突变或表达异常可导致小耳畸形相关综合症鳃-耳综合征（Panchio-oto syndrome, BOS)。Xu等(1999)报道 Eya1 + /－小鼠具有传导聋的症状。近来表观遗传学的研究进展为先天性小耳畸形病因学研究提供了新的思路。 表观遗传属于基因外遗传学修饰，其中主要的机制是DNA甲基化。本论文的研究自 2008年 1 月至2008年 12 月选择 EYA1 为候选基因对先天性小耳畸形患者进行 DNA 序列突变检测，并应用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析技术检测了先天性小耳畸形患者EYA1基因启动子区域甲基化情况，以探讨先天性小耳畸形的发病机制。
1 研究对象
病例组：选择非综合症型先天性小耳畸形患者 100 例。其中 98 例汉族，另有 1例满族和1 例土家族（均为散发病例)。男71人，女 29 人，年龄范围为 5～47 岁。包括 13 个家系（先证者和家系其他患病成员共31人)，散发患者69 人。100 例小耳畸形患者中包括小耳畸形伴耳前凹 34 例，小耳畸形伴耳前赘或副耳 22 例，小耳畸形伴腭裂 8例，小耳畸形伴面部不对称21 例医.学全.在.线网站www.med126.com，单纯小耳畸形15例。对照组：没有先天性耳部畸形的来我院进行瘢痕修复或美容手术者50 人。
2 实验方法：
2.1 EYA1基因DNA序列突变检测
抽取患者及对照组静脉血，常规提取DNA，EYA1基因设计引物覆盖了 EYA1基因所有编码区和外显子和内含子交界处的引物 12 对。应用50ul的 PCR 反应体系，包含 100ng/ｕl 基因组 DNA 1ｕl，5U/ｕl Ampli Taq polymerase 2ｕl，10×PCR 缓冲液 5ｕl, 20uM dNTPs 1ｕl，10ｕmol/L primer 0.5ｕl，双蒸去离子水补足致 35ｕl。PCR反应条件如下： 94℃预变性5min； 94℃ 30s, 58℃ 45s, 72℃30s, 10 个循环； 94℃ 30s, 53℃45s, 72℃ 30s, 35个循环； 72℃充分延伸 5min； 4℃保存。 测序反应产物纯化后加甲酰胺10uL溶解，95℃变性5min后迅速放入冰中5min上样，以 ABI 3100 Avant测序仪（ABI公司，美国)进行测序。发现序列变异者进行反向引物测序验证。应用 Genetool 软件进行测定序列与标准序列的比对。
2.2 EYA1基因甲基化实验步骤：
2.2.1 引物设计
