天热药物化学-实验指导

天然药物化学实验指导

（供药学药剂专业用)

河北医科大学药学院天然药物化学教研室

2006年3月

前 言

天然药物化学是运用现代科学理论与技术研究天然药物中化学成分的一门学科，是药学、药剂www.med126.com、药分、中药学等专业及相关专业本科学生必修的专业课，是国家职业药师(中药学)资格考试必考课程。本课程在有机化学、分析化学、有机化合物波谱学、中药学、生药学等课程的基础上，重点讲授天然药物中化学成分的化学结构、理化性质、提取分离方法、结构鉴定、生理活性、天然药物新药开发等方面的基本原理和实验技能，培养学生具有从事天然药物方面的研究、开发和生产的能力，为我国药学事业的发展输送人才。

天然药物化学实验是天然药物化学课的重要的、必不可少的组成部分。学习的主要目的是通过实验检验在课堂上所学的理论知识，使学生对理论知识的理解更加深入，掌握得更加牢固；通过实验训练学生的基本操作技能，培养学生分析问题和解决问题的能力，使学生获得从事天然药物化学科研工作的基本训练；使学生养成严谨的科学态度和良好的科学作风。

实验教学的重点是加强学生基本操作技能的训练，要求学生掌握以下技能：

（一)  提取分离方面

1. 要求掌握常用的经典方法的原理及操作。其中包括液-固提取法（浸渍、渗漉、回流提取等)、液-液萃取法（简单萃取法、梯度萃取法、逆流分布法)、重结晶法等。

2. 掌握纸色谱、薄层色谱、柱色谱的原理和基本操作。

（二) 结构鉴定方面

1. 化学方法

①掌握各类化学成分的一般定性反应在鉴定中的应用；

②掌握重要衍生物的制备方法及其在结构鉴定中的应用；

③了解重要降解反应的原理及应用。

2. 光谱方法 

了解UV、IR、NMR、MS在天然药物化学成分结构测定中的应用。

目   录

实验须知············································································································· 1

实验技能操作规范······························································································· 2

实验一  大黄中蒽醌苷元的提取、分离和检识····················································· 8

实验二  芦丁的提取、水解；黄酮类化合物与糖类的鉴别·································· 10

实验三  苦参生物碱的提取、分离、鉴别和生物碱的检识·································· 15

实验四  利用纸色谱先导设计法从洋金花中提取分离生物碱······························· 19

实验五  一叶萩碱的分离和鉴定······································································· 23

实验六  青蒿素的提取、分离和检识 ······························································· 25

实验七  穿心莲内酯的提取、分离、鉴定及亚硫酸氢钠加成物的制备················· 26

实验八  设计性实验·························································································· 29

附录··················································································································· 31

实 验 须 知

学 生 要 求

1、第一次实验前要清点所有仪器，若有缺损则向教师报告并填单补充。以后做实验时如有损坏要立即向教师报告，填单补充并按学校规定比例赔偿。最后一次实验课结束后在教师监督下清点所有仪器。

2、每次实验前要求提前预习实验内容，了解实验的原理和操作过程。实验中随时做好记录，在检查仪器装置正确后方可进行实验。实验完毕后认真总结，写好报告，提取纯化所得单体产物包好，交给老师。

3、实验中不准做与实验无关的事情，严禁吸烟、饮食、大声喧哗，未经允许不得擅自离开，并应随时注意观察实验异常情况。

4、实验结束时，应将实验室清扫干净，门、窗、水、电关好，经老师检查许可后方可离去。

实 验 室 须 知

天然药物化学实验中所用的药品多数是易燃、有毒、腐蚀性、挥发性、刺激性及易爆的药品，实验操作有时在加温加压等情况下进行，需要各种热源、电器或其它仪器，操作不慎易造成火灾、爆炸、中毒、触电等事故。所以应加强安全的责任心，提高警惕，消除隐患，遵守实验规则，避免事故。

1．仪器药品都是国家财产，须节约爱护使用；公用物品用完后立即放回原处。

2．使用易燃、易挥发及有毒的有机溶剂时，在回流、蒸馏、减压蒸馏等操作过程中，不能明火直接加热，要放沸石；若在加热时发现无沸石则应冷却后再加，防止爆沸冲出。减压系统应装有安全瓶。加液或移液时应停火或远离火源。起封易挥发溶剂瓶盖时，脸面要避开瓶口，慢慢启开，以防气体冲向脸部。

3．接触有毒及强腐蚀药品应小心操作，操作后要立即洗手。

4．实验中，若涉及有毒或腐蚀性气体产生应在通风橱中进行操作。必要时可戴好防护用具进行工作。在进行易燃性有机溶剂实验时，一定要按照操作规程进行。不可将易挥发、易燃性有机溶剂倒入水槽中，应按老师要求处理，有机废液应倒入废液瓶内。

5．实验台上不得放无用的药品仪器。在实验时要做到水槽、仪器、桌面、地上清洁整齐。

6．万一不慎着火，要沉着冷静积极抢救，立即切断室内电源和火源，用石棉布将着火部位盖严，使其断绝空气而熄灭；或视火势情况选用适当灭火器材进行灭火。在实验室宜使用二氧化碳灭火器。消防器材，沙箱、石棉布、灭火器等应放在方便固定的地点，不能随意移动，均应处于备用状态。

以下为实验室中常发生的事故，应予以特别注意且避免：

1．蒸馏或回流加热时，发现未放沸石、未等溶液冷却就补加沸石，结果溶液冲出瓶外而引起火灾。

2．蒸馏或回流易燃物或有毒物时，忘记开冷凝水，大量蒸气逸出亦易引起火灾或造成人员中毒。

3．蒸馏易燃物时塞子漏气引起火灾。

4．用三角烧瓶作减压装置的接收器容易炸裂。

5．使用真空干燥器时，用完就直接开干燥器的放气阀，结果使泵内的机油被吸到干燥器中，样品被污染。

6．实验室水槽被杂物堵塞。

第一部分 天然药化实验中常用实验技能操作规程

一、圆形（径向)纸色谱技术

（一)操作技术及程序

1. 准备仪器及试剂  培养皿、色谱滤纸、毛细管、相关试剂等。

2．准备色谱滤纸  取直径12.5cm的普通圆形滤纸，将滤纸划分出数个区间（根据所点样品的数目划分区间，滤纸不得折叠)，在此色谱滤纸中心处用铅笔轻轻画直径约为1.5～2.0cm的圆，做为点样的起始线。在此圆的中心打一小孔，将一个长方形的滤纸条搓成一个滤纸芯，插在色谱滤纸的小孔中，纸芯与色谱滤纸成直角，纸芯的高度要比培养皿上下合盖后的内部高度稍低。

3．点样  用毛细管将样品及对照品溶液点在色谱滤纸上所画的圆形起始线上，晾（吹)干。做好标记。

4．选择及配制展开剂。

5．展开  将展开剂适量倒入培养皿中，上下盖好，平衡放置，保持5分钟左右，使其内部达液～气饱和。然后将色谱滤纸小心“扣盖”在培养皿的下皿中，色谱纸保持水平，纸芯保持直立并插入展开剂中，扣好培养皿上盖。展开剂将沿小纸芯向上浸湿，到达色谱滤纸后以一个圆形的湿斑慢慢向四周扩展。在展开剂浸湿色谱纸一定距离（一般接近培养皿边沿)时即可结束展开。将色谱滤纸取出，做好展开剂到达前沿标记，自然晾干或吹干。

6．显色  根据所测样品性质选择合适的显色方法，观察色斑的位置。

7．观察实验结果  确定出化合物斑点的位置后，用尺子测量距离，计算比移值（R_f)或与标准品对照。

（二)注意事项

1．色谱纸小心取放，不要折叠、污染。

2．展开剂一定要选择合适，否则样品展开效果差。

3．点样量要合适，浓度小则展开后观察不清楚，浓度太大则有拖尾现象。

 径向纸色谱示意图

二、硅胶薄层色谱检识技术

（一) 操作技术及程序

1．准备仪器及试剂  色谱缸、TLC专用玻璃板（5cm×20cm)、研钵、薄层用硅胶G、0.5%羧甲基纤维素钠（CMC)水溶液、其它相关试剂等。

2．制板 

①硅胶G-CMC板  称取2.5～3g硅胶G放入研钵中，加入约7～9ml 的0.5%CMC水溶液（硅胶：粘合剂CMC约1：2~3)，混合成均匀的粘稠状溶液，再将其倒在TLC 玻璃板上并涂布均匀，然后轻轻颠荡，使硅胶均匀地分布在玻璃板上，形成均匀厚度的硅胶层。水平放置，自然晾干。

②荧光薄板  称取硅胶GF₂₅₄  2.5～3g，同硅胶G－CMC板法制备。

③AgNO₃-硅胶板  方法一：将AgNO₃加入少量水溶解，再加甲醇稀释成10％溶液，把预先制好的硅胶薄层浸入该溶液内约一分钟，取出避光阴干。方法二：在硅胶G中加入一定量10％硝酸银水溶液（代替水)调成糊状铺板，避光阴干。

3．活化  将自然晾干的硅胶板放于烤箱中，在105~110℃中活化0.5～1.0小时。

4．点样  在距硅胶玻璃板下端1.5～2cm处用铅笔点样轻轻划一直线，注意不破坏硅胶平面，作为点样起始线。分别用毛细管将样品及对照品溶液点在硅胶板的起始线上，晾(吹)干，做好标记。样品点的直径应在2～3mm，样品点之间的间隔应不少于1cm。

5．选择及配制展开剂。

6．展开  将展开剂适量倒入色谱缸中，将薄板放于色谱缸中（不得浸入展开剂中)，盖好上盖，保持15~30分钟左右，使其内部达液-气饱和。然后将硅胶板下端小心慢慢地插入到展开剂中，不要使展开剂浸没点样起始线，上端用玻璃物体支起，盖好上盖。此时将会观察到展开剂沿硅胶板逐渐地向上浸湿（即展开)，展开的距离一般为15cm以上。将硅胶板取出，在前沿处作出标记，自然晾干或吹干。

7．显色  根据样品性质选择合适的显色方法进行样品的显色观察。

8．计算比移值R_f及与标准品对照。

（二)注意事项

1．硅胶板小心取放，硅胶板不要受污染、刮蹭。

2．样品的点样量要合适，如果浓度小则展开后观察不清楚；如果浓度太大或点样的点直径过大可能有拖尾现象。如果样品溶液的浓度较低，可用毛细管反复在点样处多点几次。

3．展开剂一定要选择合适，否则样品展开分离效果差。.

4．荧光硅胶（硅胶-GF₂₅₄)与硅胶-G的使用方法相同，但不用显色剂，可在紫外灯（254nm)下观察样品展开情况。

三、硅胶柱色谱分离技术

（一)操作技术及程序

1．准备仪器及试剂  玻璃色谱柱、铁架台、接收瓶、相关试剂等。

2．装柱  

【湿法】 取100～200目的柱色谱用硅胶适量，置于烧杯中，加入适量的有机溶剂，搅拌使硅胶完全湿润并无气泡，然后将硅胶加入到色谱柱中。注意加硅胶时要打开活塞，让硅胶自然下沉，液面保持在硅胶之上，硅胶柱中不得有气泡。加样前，液面高度要保持在5~10mm。

【干法】取100～200目的柱色谱用硅胶适量，加入到色谱柱中，（主意要打开活塞)加时不断轻轻敲打色谱柱壁，使硅胶紧密均实。

3．加样  方法一：一般将样品溶液溶于少量开始的洗脱剂中，制成样品溶液，轻轻注入已准备好的硅胶柱上面，勿使柱面受到扰动，否则影响色谱效果。方法二：如样品不溶于开始的洗脱剂，则将样品溶于挥发性的溶剂（如乙醇、甲醇)中，然后取少量吸附剂与其拌匀，除尽溶剂，再将含有样品的吸附剂均匀地加入到色谱柱的顶端，再覆盖上少量硅胶或脱脂棉、小玻璃球将其压住，以防洗脱时冲乱顶部的拌样硅胶。

4．选择及配制洗脱剂。

5．洗脱及接收  选择好洗脱剂后，放在分液漏斗中，打开活塞慢慢连续不断地滴加在吸附柱上。同时打开色谱柱下端活塞，等份收集洗脱液，流速保持1～2滴/秒，一般先选用洗脱能力弱的溶剂，逐步增加洗脱能力。

6．同时配合TLC或其它方法检查接收液。

（二)注意事项

1．硅胶吸附拌样的比例约为： 样品：硅胶=1:1或1:2。

2．吸附剂硅胶的使用量比例约为   样品：硅胶=1:30~60或1:100(难分离物)。

3．洗脱剂的极性选择要合适，否则得不到很好的分离。

4．洗脱的速度要合适，一般保持在2~15ml/min。

色谱柱分离过程示意图

四、离子交换柱色谱分离技术

（一)操作技术及程序

1．准备仪器及试剂  色谱柱、铁架台、接收瓶、相关试剂等。

2．预处理（活化)树脂（以强酸型阳离子交换树脂为例) 按交换样品的性质选择树脂，根据树脂的交换容量及样品的量，称取适量树脂。新树脂用无水乙醇浸泡12 h以上除去杂质，再用蒸馏水浸泡24小时溶胀。将色谱柱固定在铁架台上，调节合适高度以便接收。将树脂装入色谱柱中，水液面始终浸没树脂，避免树脂中产生气泡空洞。先用5倍量的2mol/L盐酸水溶液冲洗树脂使之转为H型，再用蒸馏水冲洗为中性；然后用5倍量的5% 氢氧化钠水溶液冲洗树脂使之转为Na 型，再用蒸馏水冲洗为中性；最后用7倍量的5%盐酸水溶液冲洗树脂使之转为H型，用蒸馏水冲洗为中性，待用。

3．交换  将样品的水溶液从色谱柱上端加入，按流出液约2~4滴/秒的速度进行交换。

4. 再交换（洗脱) 用合适的方法再将交换到树脂上的成分交换下来并接收。

5．再生  将使用完后的树脂采用活化的方法进行再生。

（二)注意事项

1．离子交换树脂的交换容量一般在1~10mmol/g，选择树脂时要看说明书的技术指标。但实际的交换容量受溶液的pH值及生产批次等的影响，都比理论值要小。

2．始终保持液面高度高于树脂，以免发生树脂中溶液干涸。树脂内部不能有气泡空洞。

3．在树脂柱上部再加盛有待交换的样品溶液的滴液漏斗，方便加液。

4．随时检查交换情况。

五、渗漉提取技术

（一)操作技术及程序

1．准备仪器及试剂  渗漉筒、铁架台、霍夫曼夹、接收瓶、相关试剂等。

2．粉碎药材  将药材粉碎成50目左右，以利于提取溶剂进入药材内部。

3．配制提取溶剂 

4．渗漉及接收  将渗漉筒固定在铁架台上，调节合适高度以方便接收，筒内下端放置纱布或滤纸，关闭霍夫曼夹。将药材放在烧杯中，加少量提取溶剂搅拌润湿后，放入渗漉筒中，将药材适当压紧。从渗漉筒上部加入提取溶剂将药材浸没，保持浸泡一定时间。打开霍夫曼夹，从下端接收提取溶液（渗漉液)，渗漉速度一般为3~6ml/min。

5．即时检查  用合适的方法随时检查是否含有待提取的成分。

（二)注意事项

1．在渗漉提取中应始终保持提取溶剂完全浸没药材。

2．当渗漉液中检查不出提取成分或低于要求时，即可认为提取结束。

六、索氏提取技术

（一)操作技术及程序

1．准备仪器及试剂  索氏提取器、铁架台、热源（如电热套或水浴)、相关试剂等。

2．安装仪器  选取合适规格的索氏提取器，按照由下到上的顺序安装固定好索氏提取器（即先放置好热源，其次固定好溶剂瓶，再安装提取器中心部分，最后安装冷凝器)。整套仪器应保持垂直。

3．处理样品及加样  将待提取的固体样品用滤纸包好，放入索氏提取器的中心部分。

4．加提取溶剂  取适量提取溶剂放入溶剂瓶中，并加沸石。

5．加热回流提取  打开冷凝水，调节热源进行加热回流提取。

6．提取结束  首先关闭热源，待提取液完全冷却后再按由上到下的顺序拆缷仪器，并将提取液转移到合适的容器中。

（二)注意事项

1．如果用非水溶剂提取则整套索氏提取器应无水干燥。

2．待提取样品要用滤纸包紧，上端用重物（如玻璃球)压住，以免受溶剂浸泡时上浮飘起。待提取样品放置的高度不应超过仪器中心部分中的虹吸管高度。

3．加热回流前要在溶剂瓶中放沸石，溶剂使用量不应超过溶剂瓶体积的2/3。

4．加热前应检查整套仪器磨口连接部分是否密闭。

		1.冷凝器 2.溶剂蒸气上升管 3.虹吸管 4.装有药物的滤纸筒 5.溶剂 6.水浴

七、回馏（提取)技术（见有机化学实验操作规范)

八、蒸馏及减压蒸馏（浓缩)技术（见有机化学实验操作规范)

九、重结晶及抽滤技术（见有机化学实验操作规范)

十、分液漏斗萃取技术（见分析化学实验操作规范)

第二部分 天然药化实验内容

实验一  大黄中蒽醌苷元的提取、分离和检识

一、实验目的和要求

1．学习从大黄中提取分离蒽醌类化合物的方法。

2．掌握硅胶柱色谱的原理和操作技术，学会干法及湿法装柱。

3．了解蒽醌类化合物的检识方法。

 二、实验原理  （综合性实验)

大黄记载于《神农本草经》等许多文献中，具有泻热通肠、凉血解毒、逐淤通经之功效，用于泄下、健胃、清热、解毒等。自古以来，大黄在植物性泻下药中肯有重要作用，是一味很早就被各国药典所收载的世界性生药。大黄的种类繁多，优质大黄是蓼科植物掌叶大黄（Rheum palmatclm L)、大黄（R. officinale Baill)及唐古特大黄（R. tangutium Maxim.et Regll)的根茎及根，大黄中含有多种游离的羟基蒽醌类化合物以及它们与糖所形成的苷。已经知道的羟基蒽醌主要有下列五种：

 大黄中蒽醌苷元，其结构不同，因而酸性强弱也不同。大黄酸连有-COOH，酸性最强；大黄素连有β-OH，酸性第二；芦荟大黄素连有苄醇-OH，酸性第三；大黄素甲醚和大黄酚均具有1,8-二酚羟基，前者连有-OCH₃和-CH₃，后者只连有-CH₃，因而后者酸性排在第四位。

为提高游离的蒽醌苷元的提取收率，先采用酸水解使大黄粉中苷元含量增加，因苷元的亲脂性强，水解物再用乙醚进行提取；提取后再依据苷元的不同结构及极性，采用柱色谱的技术进行分离。

三、实验内容

（一)实验仪器及药品

玻璃色谱柱（21mm×200mm)及配套分液漏斗，100ml三角瓶，蒸发皿，试管，玻璃板（5×20cm)，色谱缸，滤纸，玻璃漏斗，铁架台，脱脂棉，250ml园底烧瓶，恒温水、浴锅，抽滤瓶，布氏漏斗，冷凝器，紫外灯。

大黄粉（购)。硅胶（柱色谱用100~200目)；硅胶G（薄层色谱用)，乙醚（分析纯)，石油醚（60~90℃)，乙酸乙酯（分析纯)，20％H₂SO₄，1%NaOH ，0.5%CMC溶液，1%茜草素乙醇溶液，0.5%醋酸镁甲醇溶液。

（二)实验操作

1．总蒽醌苷元的提取   取大黄粉5g放于250ml的圆底烧瓶中，加入20%H₂SO₄水溶液60ml，在水浴上加热2小时，抽滤，滤饼用水洗近中性后于70℃左右干燥。滤饼干燥后，加入乙醚20ml浸泡，放置2~3天。

2．硅胶柱色谱分离蒽醌苷元 

（1)装柱：

【干法】色谱柱用铁架台固定后，将一小团脱脂棉放于柱底部使形成一个较松的垫层，打开活塞。称取柱色谱用硅胶25g，通过玻璃漏斗加入到色谱柱中，加时要轻轻敲打柱壁使之均实。

【湿法】色谱柱用铁架台固定后，将一小团脱脂棉放于柱底部使形成一个较松的垫层，关闭活塞，倒入少量洗脱剂。取柱色谱用硅胶25g，置于100ml烧杯中，加入约40ml石油醚（60~90℃)搅拌使硅胶完全湿润并无气泡，然后将硅胶加入到色谱柱中。要注意加硅胶时要始终将液面在硅胶固体之上，且不要有气泡，可打开活塞调节液面高度，加完后液面比硅胶固体高约5~10mm。

（2)拌样：过滤乙醚提取液，将滤液慢慢滴加到盛有约0.5~1g硅胶的蒸发皿中，使液体挥干，得完全干燥的拌样硅胶。

（3)加样：将拌样硅胶加入到柱色谱的顶端，然后再加入少量硅胶或脱脂棉，以防洗脱时冲乱顶部的拌样硅胶。

（4)洗脱及收集：用石油醚—乙酸乙酯（7:3)为洗脱剂进行洗脱（配制洗脱剂约200ml)，待最初的有色段向下移动到距硅胶柱底端约10mm左右时，开始收集，约5~7ml为一份，至主要成分洗脱完全为止。

（5)TLC检识：制备硅胶G—CMC板4块，制备方法见《实验技术操作规范》第4页。展开剂为石油醚（60~90℃)—乙酸乙酯（7:3)，配10ml。点样：总提取物（乙醚浸泡液)和各份洗脱收集液。结果在可见光下总提取物可看见5个斑点，依R_f值大小分别为大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素、大黄素、大黄酸（基本在原点)，也可在紫外光下观察。根据TLC检查结果， 将相同成分洗脱液合并，水浴回收溶剂，即得分离后的单体化合物。

3．蒽酯类化合物的检识

（1)碱液试验：取样品洗脱液及1%茜草素乙醇溶液各2ml，分别加入1%NaOH水溶液2ml ，振摇放置分层后，观察颜色变化。

（2)乙酸镁试验：在一小张滤纸上滴加样品溶液及1%茜草素乙醇溶液各1滴，干燥，喷0.5%乙酸镁甲醇溶液，于80℃加热5min，观察斑点颜色。

四、思考题

1．大黄中总蒽醌苷元的提取分离原理是什么？

2．大黄中5个蒽醌苷元用硅胶薄层色谱进行检识，以石油醚－乙酸乙酯（7:3)为展剂，其结果如何？

实验二 芦丁的提取、水解、黄酮类与糖类化合物的鉴别

芦丁（Rutin)亦称芸香苷（Rutoside)广泛存在于植物界中，现已发现含芦丁的植物至少在70种以上，如烟叶、槐花、荞麦和蒲公英中均含有。尤以槐花米（为植物Sophora japonica的未开放的花蕾)和荞麦中含量最高，可作为大量提取芦丁的原料。

芦丁具有维生素P样作用，有助于保持及恢复毛细血管的正常弹性，主要用作防治高血压病的辅助治疗药。

一、实验目的和要求

1．掌握从槐花米中提取与精制芦丁的原理和方法。

2．掌握由黄酮苷水解制取黄酮苷元的方法。

3．掌握纸色谱的操作技术。

4．了解黄酮类化合物和糖类的一般性质。

5．通过测定芦丁及槲皮素的紫外光谱，了解如何利用紫外光谱对黄酮类化合物进行结构测定。

二、实验原理（综合性实验)

芦丁为浅黄色粉末或极细的针状结晶，含有三分子的结晶水，mp 174~178℃，无水物mp188~190℃。溶解度：冷水中为1:10000；热水中1:180；冷乙醇1:650；热乙醇1:60；冷吡啶1:12。微溶于丙酮、乙酸乙酯，不溶于苯、乙醚、氯仿、石油醚，溶于碱而呈黄色。本实验利用芦丁具有弱酸性在碱水中成盐而增大溶解能力，用碱水（石灰水)为溶剂煮沸提取，碱水提取液加酸酸化后又可析出芦丁的结晶，并利用芦丁对冷水和热水溶解度相差悬殊的特性进行精制。

芦丁是由槲皮素（Quercetin)3位上的羟基与芸香糖（Rutinose)〔为葡萄糖（Glucose)与鼠李糖（Rhamnose)组成的双糖〕脱水合成的苷。所以芦丁酸水解可得到苷元槲皮素和葡萄糖、鼠李糖。

  Rutin Quercetin

三、实验内容

（一)实验仪器及药品

烧杯（500ml、1000ml、50ml)园底烧瓶（250 ml)，玻璃漏斗，抽滤瓶，布什漏斗，三角瓶（100ml)，蒸发皿，浓氨水，试管，玻璃板（5×20cm)，色谱缸，滤纸，铁架台，脱脂棉，冷凝器，紫外灯等。

槐花米，氧化钙，10％HCl，1％H₂SO₄，无水吡啶，醋酐，95％乙醇，氢氧化钡，冰醋酸，乙酸乙酯，甲酸，浓硫酸，镁粉，浓盐酸，氢氧化胺，硅胶G，葡萄糖、鼠李糖的水溶液，邻苯二甲酸-苯胺试剂，标准芦丁、槲皮素的乙醇溶液，1％AlCl₃的乙醇溶液，1％的葡萄糖溶液，1％的蔗糖溶液，1％的可溶性淀粉溶液，α-萘酚试液，1％ 芦丁乙醇溶液，1％槲皮素的乙醇溶液，1％ 橙皮苷的甲醇溶液，黄芩苷的乙醇饱和溶液，1％FeCl₃试液，2% ZrOCl₂的甲醇溶液，2%柠檬酸的甲醇溶液，0.5％ 醋酸镁甲醇溶液，甲醇钠试液，无水醋酸钠，硼酸，无水三氯化铝溶液等。

（二)实验操作

1．芦丁的提取与精制

见如下流程

 槐花米30g（研碎)

 置于500ml烧杯中，加300ml热水，在搅拌下加饱和

【提取】  石灰水调至pH8，加热煮沸10min，趁热用纱布过滤

药渣  滤液

加pH8（用石灰水  滴加10％HCl调pH=4~5 ,放置

调)水溶液250ml  充分冷却，待沉淀完全后，抽滤，

煮提10min，趁热过滤  沉淀用水洗至中性，自然干燥，称重。

合并

药渣（弃去)  滤液

  沉淀（芦丁粗品)

  【精制】   悬浮于蒸馏水（约600ml)中 

  加热煮沸10min至溶液澄清，趁热过滤

不溶物（弃去)滤液

  放置充分冷却，抽滤

   沉淀用水洗至中性

沉淀（精制芦丁)

（自然干燥后称重)

注：取少量固体氧化钙加水搅拌，至有不溶物存在，放置，取上清液即为饱和石灰水。

2．芦丁的水解

称取精制芦丁1g置于250 ml园底瓶中，加入1％ H₂SO₄100ml(V/V) 隔石棉网直火微沸回流约30min（注意观察现象：未加热时，瓶内为混悬液，加热后，混悬液逐渐变为澄清液，继续加热，澄清液体又逐渐变为混悬液。)待水解完毕后，冷却水解液。滤取沉淀，滤液保存于三角瓶中待作糖的检识，所得沉淀用少许水洗除酸，干燥称重，计算苷元与糖的重量比。沉淀用乙醇（95%大约10-20ml)进行重结晶，即得苷元（槲皮素)。

3．槲皮素乙酰化物的制备

取槲皮素200mg，置于50ml圆底烧瓶内，加入4ml无水吡啶，于水浴上加热回流，使其完全溶解，再加入5ml醋酐，摇匀，水浴上加热回流30min，放冷，将反应液在搅拌下倾入150ml冰水中，一直搅拌至油滴消失，固体沉淀析出，抽滤析出的白色沉淀，用水洗至中性，干燥，再用95％乙醇重结晶，得细针状结晶，测定其熔点，并与文献记载的五乙酰基槲皮素的熔点（193～195℃)对比。

4．色谱检识

   （1)糖的纸色谱检识

糖溶液的处理： 取水解芦丁时的滤液20ml，加适量Ba(OH)₂细粉，边加边搅拌，使溶液调到中性（pH＝7)，用玻璃漏斗过滤至蒸发皿中，在水浴上浓缩至约2ml左右，供纸色谱点样用。

点样： 标准品：葡萄糖、鼠李糖的水溶液（2mg/ml)。

  样品液：酸水解浓缩液

展开剂：  ① 正丁醇：冰醋酸：水（4:1:2不分层)配制14ml

② 正丁醇：冰醋酸：水（4:1:5取上层)配制5倍，放到分液漏斗中，平衡后取上层。

展开方式： 用径向纸色谱法，操作见《实验技术操作规范》第3页

显色剂：  喷雾邻苯二甲酸-苯胺试剂，用电吹风加热至出现棕褐色斑点。

色谱结果：  将样品色斑与标准品色斑对照并计算R_f值，作出结论。

（2)芦丁和槲皮素的色谱检识

点样： 标准品：标准芦丁、槲皮素的乙醇溶液（1mg/10ml)

   样品液：取少量自制的芦丁、槲皮素放于试管中加少量95％乙醇，水浴加热溶解。

制板： 制备硅胶G-CMC板，方法见《实验技术操作规范》第4页

展开剂： 乙酸乙酯：甲酸：水（8：1：1)

展开方式：上行法

显色剂： 喷雾1％AlCl₃的乙醇溶液或在紫外灯（365nm)下观察荧光。

色谱结果：将样品色斑与标准品色斑对照并计算R_f值，给出结论。

5. 化学反应检识

（1)糖类成分的检识反应

①取4支试管，分别加入1％的葡萄糖溶液、1％的蔗糖溶液、1％的可溶性淀粉溶液和蒸馏水各1ml，各试管均加入α-萘酚试液2~3滴，混合后，沿试管壁加浓硫酸1ml，使硫酸层集于下层，观察两相溶液界面处的颜色，并比较4个试管反应的异同。

②取一滤纸条（约12×3cm)，用铅笔划三个圆圈，于各圆圈内分别点1％的葡萄糖溶液、1％的蔗糖溶液、1％的可溶性淀粉溶液一滴，待干燥后，喷雾邻苯二甲酸－苯胺试剂，置100℃加热数分钟或用电吹风加热，观察并比较三个圆圈斑点的颜色。

（2)黄酮类化合物的识别反应

① 取3支试管，分别加入1％ 芦丁、槲皮素的乙醇溶液和1％ 橙皮苷的甲醇溶液各1~2ml，再各加入1％ FeCl₃试液1滴，观察现象。

② 取3支试管，分别加入1％ 芦丁、槲皮素的乙醇溶液和1％ 橙皮苷的甲醇溶液各1~2ml，各均加少许镁粉，混匀，分别缓缓滴加浓盐酸（2~3滴)，观察颜色变化情况。

③ 取3支试管，分别加入1％ 芦丁、槲皮素的乙醇溶液和1％ 橙皮苷的甲醇溶液各1~2ml，再各加入α-萘酚试液2~3滴，混合后，沿试管壁加浓硫酸1ml，使硫酸层集于下层，观察两相溶液界面处的颜色。

④ 取2支试管，分别加入1％ 槲皮素的乙醇溶液和黄芩苷的乙醇饱和溶液各1~2ml，然后加入2% ZrOCl₂的甲醇溶液数滴，注意观察颜色变化情况；再继续向试管中加入2%柠檬酸的甲醇溶液，观察颜色变化情况。

⑤ 取一滤纸条(12×3cm)，用铅笔划三个圆圈，于各圆圈内分别点1％的芦丁、1％的槲皮素和1％ 的橙皮苷溶液各一滴，干燥后，

a．在日光和紫外灯下观察三个样品的颜色，作好记录；

b．将纸条放在水蒸气流中1分钟，再置氨气流中片刻，观察在日光和紫外灯下颜色变化；

c．将纸条放在通风处放置10min后，再在日光和紫外灯下观察颜色有什么变化；

d．最后再于三个圆圈部位喷雾1％ AlCl₃的乙醇溶液，干燥后，于日光和紫外灯下观察颜色的变化。

⑥取一滤纸条（15×3cm)，用铅笔划三个圆圈，于各圆圈内分别点1％的芦丁、1％的槲皮素和1％的橙皮苷溶液各一滴，干燥后，喷雾0.5％ 醋酸镁甲醇溶液，于90℃加热5min，在日光和紫外灯下观察有什么颜色变化。

6．芦丁及槲皮素的紫外光谱测定

   （1)试剂的配制

a)甲醇钠溶液（NaOMe)：取新切割的金属钠2.5g，小心分次加入到100ml干燥的光谱纯的甲醇中，所得溶液密塞贮存于玻璃容器中。

b)无水醋酸钠（NaOAc)：如有粉末状无水NaOAc（A.R)，可直接供用。如无，则取醋酸钠（NaOAc.3H₂O)置蒸发皿中，于120℃干燥2小时，粉碎即可。

c)硼酸（H₃BO₃)：在程序A的情况下，可直接取无水粉末状H₃BO₃（A.R)。

在程序B的情况下，取光谱纯MeOH，加入无水粉末状H₃BO₃使成饱和溶液后供用。

d)无水三氯化铝溶液（AlCl₃)：取1g无水AlCl₃（C.P)，小心加入到20ml光谱纯甲醇中，放24小时后即溶解。

e)盐酸（HCl)贮备液：取浓HCl（A.R)50ml，与蒸馏水100ml混匀后密塞贮存于玻璃中，备用。

以上贮备液可保存半年之久。取30ml滴瓶，每个滴瓶分别盛上述贮备液20ml，放于紫外分光光度计旁，供测定时用。

（2)测定方法：精密称取芦丁10mg于100ml容量瓶中，加甲醇溶解，并稀释到刻度，摇匀。从中吸取5ml于50ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀备用（20μg/ml)。

① 甲醇光谱：取样品溶液置石英杯中，在200～550nm内进行扫描，重复一次，观察紫外光谱。

② 甲醇钠光谱：取样品溶液置石英杯中， 加入3滴NaOMe贮备液后，立即测定“样品+NaOMe”溶液的UV光谱，过5min后重新测定一次，以核对黄酮类化合物的分解情况。

③ AlCl₃光谱：在置有样品溶液的石英杯中，加入6滴AlCl₃贮备液，停一分钟测定“样品+AlCl₃”溶液的UV光谱。然后加3滴盐酸贮备液后，立即测定“样品+AlCl₃/HCl”溶液的UV光谱，随即倒掉杯内溶液。

④ 醋酸钠光谱：取样品溶液2～3ml，加入粉碎的无水NaOAc振摇，至比色杯底约留有2mm厚的NaOAc时，立即测定“样品+ NaOAc”溶液的UV光谱；然后再过5min作第二次测定，以核对分解情况。

⑤ 醋酸钠-硼酸光谱：

方法Ⅰ，在盛有样品及醋酸钠的石英杯中，加入足量的硼酸使成饱和溶液，然后进行测定。本法适用于在加入醋酸钠5分钟后无分解现象者。

方法Ⅱ，于样品溶液约3ml中加入5滴H₃BO₃贮备液，然后加入NaOAc粉末，使之快速饱和后，测定“样品+ NaOAc/H₃BO₃”的UV光谱。

根据测定结果试解析光谱并初步判断其结构，并说明理由。

四、思考题

1．提取芦丁工艺中影响产量和质量的因素是什么？

2. 提取苷类化合物时应注意什么？

3．芦丁和槲皮素用不同展开剂系统展开将出现什么结果？ 为什么？

实验三  苦参生物碱的提取、分离、鉴别和生物碱的检识

苦参为豆科(Leguminosae)植物苦参（Sophora flavescens Ait)的根，味苦性寒，有清热利湿、袪风杀虫及解毒等功效。主要用于湿热黄疸、赤白带下、痛肿疮毒、皮肤疥癣以及腮炎、痢疾等。

苦参中主要含有苦参碱、氧化苦参碱、N—甲基金雀花碱、氧化槐果碱、槐定碱等成分。苦参总碱及氧化苦参碱都具有减慢心率的作用，可用于心室早博等心律失常之症，苦参制剂也常用于急性菌痢、滴虫病、白细胞减少症、皮肤骚痒等多种疾病。目前药理实验表明苦参碱、氧化苦参碱等具有抗肿瘤作用。

一、实验目的和要求

1．掌握离子交换法提取苦参生物碱的原理及方法

2．掌握连续回流提取法的基本操作。

3．了解阳离子交换树脂的性能和处理方法

二、实验原理（苦参生物碱的理化性质与结构，综合性实验)

1．苦参碱（matrine)：有四种形态，α－苦参碱为针状或柱状结晶，mp. 76℃，[α]_D＋39°；β－苦参碱为柱状结晶，mp. 84℃；γ－苦参碱为液体，bp. 223℃/6mmHg；δ－苦参碱是柱状结晶，mp. 84℃。常见是的α－苦参碱。当β－苦参碱在石油醚中22～24℃放置后，能析出α和β型苦参碱的混合结晶，而α－苦参碱的溶液放置在10℃时，能析出β-苦参碱结晶，用过氧化氢处理苦参碱可转变为氧化苦参碱。四种形态的苦参碱的苦味酸盐相同，mp. 167～169℃。  

2．氧化苦参碱（Oxymatrine)：C₁₅H₂₄N₂O_2，无色柱状结晶（Me₂CO)，mp.162～163℃（水合物)，207℃（无水物)。[α]_D+47.7°（EtOH)。可溶于冷水、乙醇、氯仿，难溶于乙醚、石油醚。用SO₂处理可转变为苦参碱。

3．N－氧化槐果碱（N－Oxysophocarpine)：白色簇状结晶，mp. 206℃

4．槐定碱（Sophoridine)：为苦参碱的一种空间异构体，白色棱晶，mp. 106～108℃

苦参碱氧化苦参碱 N－氧化槐果碱  槐定碱

5．其它生物碱的结构为：

（1)安那吉碱Anagyrine：稳定性大，不被皂化，bp. 210～215℃／4mmHg

（2)苦参烯碱Sophocarpine：mp. 54℃

（3)苦参醇碱Sophoranol：mp. 171℃

   （1) （2) （3)

苦参生物碱是喹喏里西丁类生物碱，能与酸成盐而溶于稀酸水，将其盐的水溶液通过阳离子交换树脂柱进行交换，交换树脂用浓氨水碱化，再用氯仿提取得到苦参总生物碱。 

三、实验内容

 （一)仪器与试剂

玻璃色谱柱（21mm×200mm)及配套分液漏斗，烧杯（50 ml，500 ml，1000m1)，渗漉筒，滤纸，纱布，100ml三角瓶，索氏提取器，恒温水浴锅，蒸发皿，试管，玻璃板（5×20cm)，色谱缸，滤纸，玻璃漏斗，铁架台， 250ml园底烧瓶，恒温水浴锅，抽滤瓶，布氏漏斗，冷凝器等。

苦参粗粉，732型强酸性阳离子交换树脂，硅胶G，乙醇，浓氨水，氯仿，无水硫酸钠，丙酮，甲醇，2mol/L HCl，0.1％HCl，5％NaOH溶液，氢氧化钠，乙醚， 5％ 钼酸铵，浓硫酸，浓硝酸，漂白粉，碘化铋钾试剂，改良的碘化铋钾试液，碘化汞钾试剂，硅钨酸试剂，10％ 硫酸铜试剂，氯化汞乙醇溶液，0.1%H₂SO₄奎宁水溶液，0.1%H₂SO₄小檗碱水溶液，0.1%H₂SO₄阿托品水溶液，苦参生物碱水溶液（自制)，1％ 盐酸麻黄碱水溶液，盐酸小檗碱水溶液，氢溴酸东莨菪碱溶液，硫酸阿托品溶液等。

（二)实验操作

总生物碱的提取

1．树脂的处理  由于市售的阳离子交换树脂为钠型，同时含水量不足未充分膨胀，而往往含有杂质，因此使用前需进行转型、除杂和吸水膨胀处理。

树脂规格：732型强酸性阳离子交换树脂，交换容量：45毫克当量，交联度：1×7。

称取40克干树脂置于100ml三角瓶中，加少量酒精或水浸泡过夜，次日倒出酒精，用蒸馏水洗至溶液澄清，然后倒入交换柱中。先用约300ml（约8倍量)2mol/LHCl以5～6ml/min的速度进行交换，使其转为氢型，然后用水洗至流出液呈中性；接着再用约300ml（8倍量)5％NaOH水溶液以同样速度使其复回钠型，再用蒸馏水洗至液呈中性（必要时也可再重复一次盐酸和氢氧化钠的处理)，最后用300ml（8倍量)的2mol/LHCl进行交换，使之转为氢型，蒸馏水冲洗至中性，待用。

2．渗漉

称取苦参粗粉150g，用适量0.1％HCl搅拌湿润膨胀后，装入渗漉筒中（渗漉筒底部铺一层纱布)，药材要分次加入，一层一层压紧，压力要均匀，不要太紧，装完后上面盖一张滤纸，用玻璃塞压住，加0.1％HCl浸泡过夜。次日以0.1％HCl为溶剂以4～5ml/min的速度渗漉（渗漉液最好用滤纸过滤一次)，边渗漉边检查生物碱反应（或测定pH的变化)，至渗漉液生物碱反应不明显为止（渗漉液约1500左右，或渗漉液颜色较浅)。

注：（1)提取溶剂如酸度太大或用量过大，交换时可将吸附于树脂上的生物碱洗脱下来，因此渗漉溶剂酸度和用量要合适。

（2)生物碱反应检查：将流出液滴在滤纸上，喷雾碘化铋钾试剂，如有橙红色斑点为正反应，无橙红色斑点为负反应。

3．交换

将渗漉液通过处理好的强酸性阳离子树脂，交换速度为4～5ml/min，或以检查流出液是否有生物碱来控制交换速度。交换完毕后，将树脂倒入250ml烧杯中，用蒸馏水洗至洗液无色，再用乙醇洗两次，将树脂倒至蒸发皿中，自然晾干（或于40～50℃烤箱中烤干)。

4．连续提取

将上述晾干的树脂放至烧杯中，加10ml左右的浓氨水拌湿（以手捏成团但不粘手为宜)，内置20min（盖好)，装入滤纸袋置索氏提取器中，用200ml的氯仿为溶剂连续回流提取至提取液无生物碱反应，约2 h（于恒温水浴中，水浴温度为80～90℃)。回流完毕后，氯仿提取液加无水硫酸钠（炒干)干燥脱水。干燥至少半小时以上过滤，回收氯仿至干（蒸至少量时倒入50ml烧杯中，继续将氯仿挥尽)，残留物加入少量丙酮，热溶，放置，析晶。数日后加少量丙酮处理结晶，抽滤（结晶用少量丙酮洗一次)，干燥，即得粗品总碱（黄白色结晶)。

5．精制

将粗品用约20倍的丙酮于100ml三角瓶中热溶解，趁热过滤，滤液放置冷却。待沉淀完全后，抽滤，结晶用丙酮洗涤一次，置干燥器，称重，即得以氧化苦参碱为主的精品总碱。

6．总碱的薄层色谱鉴定

制板：制备硅胶G-CMC板，方法见《实验技术操作规范》第4页

点样：样品液：取少量自制苦参总生物碱放于小试管中加适量氯仿溶解。

  母液；标准品：苦参碱和氧化苦参碱（用适量氯仿溶解)

展开剂：氯仿-甲醇-浓氨水（8:2:0.25)

展开方式：上行法

显色剂：喷雾改良的碘化铋钾试液

色谱结果：对照样品色斑与标准品斑点的颜色和位置，计算R_f值，并观察母液中有多少生物碱的斑点，做出结论。

7. 生物碱类化合物的检识

生物碱除少数（如麻黄碱)外，均与各种生物碱沉淀试剂在弱酸性溶液中反应，生成沉淀；而部分生物碱又各自与不同的显色试剂反应，生成各种有色物质。

1)生物碱沉淀反应

（1)碘化铋钾沉淀反应：取4支试管，分别加入0.1%H₂SO₄奎宁水溶液、0.1%H₂SO₄小檗碱水溶液、0.1%H₂SO₄阿托品水溶液及苦参生物碱水溶液各1ml，然后在各试管中均加入碘化铋钾试剂，混匀，观察生成沉淀的情况。

    （2) 碘化汞钾反应：取4支试管，分别加入0.1%H₂SO₄奎宁水溶液、0.1%H₂SO₄小檗碱水溶液、0.1%H₂SO₄阿托品水溶液及苦参生物碱水溶液各1ml，然后在各试管中均加入碘化汞钾试剂，混匀，观察生成沉淀的情况。

（3)硅钨酸沉淀反应：取4支试管，分别加入0.1%H₂SO₄奎宁水溶液、0.1%H₂SO₄小檗碱水溶液、0.1%H₂SO₄阿托品水溶液及苦参生物碱水溶液各1ml，然后在各试管中均加入硅钨酸试剂，混匀，观察生成沉淀的情况。

2) 显色反应  取一张滤纸条，在其上分别滴加0.1% H₂SO₄奎宁水溶液、0.1% H₂SO₄小檗碱水溶液、0.1% H₂SO₄阿托品水溶液及苦参生物碱水溶液各1滴，干燥后喷雾改良的碘化铋钾试剂，观察各种样品显色情况。

 3)个别生物碱的颜色反应

（1)麻黄碱的反应：取一支试管加入1％ 盐酸麻黄碱水溶液1ml，加入10％ 硫酸铜试剂2～3滴，用氢氧化钠碱化，即显兰紫色；再往试管中加入乙醚，振摇分层后，醚层呈紫红色（二水合物)，水层呈兰色（四水合物)。反应原理为：

（2)莨菪碱和东莨菪碱的反应：

东莨菪碱与5％ 钼酸铵的浓硫酸溶液加热反应，初生成黄色，后变为兰色，阿托品不显色。

取少量硫酸阿托品及氢溴酸东莨菪碱分别置2支试管中，加入氯化汞乙醇溶液，阿托品生成黄色沉淀，加热后转为红色；东莨菪碱生成白色沉淀。

（3)小檗碱的反应：

取盐酸小檗碱水溶液2ml，加入浓硝酸数滴，可得黄绿色硝酸小檗碱沉淀。

取盐酸小檗碱少许，加稀盐酸2ml溶解后，加漂白粉少许即产生红色。

四、思考题

1. 离子交换树脂提取生物碱的原理是什么？其方法有什么特点？

2. 根据苦参生物碱的性质，请设计用溶剂法提取苦参生物碱的流程。

3. 使用索氏提取器有什么优点？应注意哪些问题？

实验四  利用纸色谱先导设计法从洋金花中提取分离生物碱

洋金花是茄科（Solanaceae)植物白曼陀（S.Daturametel  L.)或毛曼陀（S.Datura innoxia Mill)的干燥花，前者称南洋金花，后者称北洋金花。曼陀罗的叶、花、根和种子均含有大量生物碱（0.2～0.5％)，主要为莨菪碱（hyoscyamine)、东莨菪碱、颠茄碱和去水阿托品。在花中主要是莨菪碱和东莨菪碱。北洋金花中东莨菪碱的含量较高，约为0.344％。洋金花味辛性温、有毒，具有定喘、麻醉止痛之功效，主治哮喘、惊痫、风湿痹痛等，还可作手术麻醉剂。民间将洋金花与烟丝或烟叶混合，做成烟卷，用以治疗老年性慢性气管炎哮喘，对缓解支气管平滑肌痉挛有明显疗效。

一、实验目的

1．了解纸层析先导设计法的原理与操作

2．掌握洋金花中东莨菪碱和莨菪碱的理化性质与提取分离方法

3．掌握逆流分溶法（CCD法)的原理与操作

二、实验原理（综合性实验)

（一)洋金花中主要成分的结构性质及提取分离原理

1.东莨菪碱(hyosine or scopolamine)  为粘稠状液体，其一分子水合物为结晶体，mp 59℃，[α]_D-18^o，具有极强的亲水性，可溶于水（1:9.5)，易溶于热水、乙醇、乙醚、氯仿、丙酮，难溶于四氯化碳、苯或石油醚。其碱性较弱(K_b=3.5×10^-7)，不能与HgCl₂生成HgO的黄色沉淀。

2.莨菪碱(hyocyamine or atropine)  为固体，mp 108. 5℃，[α]_D-22^o(EtOH)。其溶于无水乙醇中，加0.16％的氢氧化钠或120℃加热30min，经消旋即可转为阿托品。阿托品为长柱状结晶，mp 118℃，易溶于乙醇、氯仿，可溶于四氯化碳、苯，几乎不溶于石油醚。碱性比东莨菪碱强(K_b=4.5×10^-5)，能与HgCl₂生成黄色HgO沉淀，加热后转为红色。

 莨菪碱  东莨菪碱

东莨菪碱和莨菪碱均能与酸成盐而溶于水，在碱化后游离出生物碱而溶于氯仿，利用此性质用酸水将洋金花中生物碱提取出来，碱化后用氯仿萃取得到总碱，而利用纸色谱先导法的方案将莨菪碱与东莨菪碱分离。

（二)纸色谱先导设计法简介

纸色谱先导设计法是以纸色谱的结果及计算数据作指导，来设计液—液两相萃取法分离天然药物化学成分的研究方案。纸色谱属于分配色谱，固定相和流动相分别为吸附在色谱滤纸上的水（或预先涂布的其它固定相)和展开剂，根据不同物质在水相与有机相之间的分配系数不同而得到分离。因此我们可以根据不同成分纸色谱的比移值R_f来设计液—液萃取的实验方案。

纸色谱先导法的设计程序分为四个步骤：

1. 溶剂系统的选择：

(1)选择提取溶剂：提取溶剂是指从药材或水提液中提取某种（或某组)成分所用的溶剂。最佳的提取溶剂应为纸色谱时该种（或该组)成分R_f值最大的展开剂。因为色谱的R_f值越大，分配系数K越大，萃取率就越高。所以，可用纸色谱法选择其中R_f值最大的展开剂作为提取该物质的最佳萃取溶剂。

当采用润湿指数为1.5的半湿色谱滤纸时，K值与R_f值的近似关系式如下所示：

  式中：K=C_有机相/C_水相

(2)选择分离混合物的溶剂：在分离纸色谱比移值为R_f1及R_f2(R_f1 ＞R_f2)的两个化合物时，可以用分离因子β表示这两种化合物可分离的难易程度：

分离因子β越大，两种物质越易分离。因此在选择分离溶剂系统时，应尽量选β值大者的溶剂系统。一般情况下，ΔR_f越大，则β值越大越容易分离。当在该条件下用纸色谱的展开剂做为萃取溶剂时，R_f值最大的化合物易转入萃取溶剂中，而R_f小的化合物则留在水相中，从而达到了分离的目的。

分离混合物的溶剂还要具备下述条件：两相溶剂能很快的分层；振摇时不易发生乳化现象；溶质与溶剂不发生化学反应（特殊需要者例外)等。

选择溶剂时具体做法如下：

①色谱滤纸的处理：称量色谱滤纸重W₁，然后将色谱滤纸浸入蒸馏水(或其它固定相)中，迅速取出，夹于两张滤纸中间。吸去多余水分，至湿润的色谱滤纸重W₂约为W₁的1.5倍。此时滤纸的湿润指数即为1.5。

②点样展开及确定溶剂系统：取湿润指数约为1.5的半湿色谱滤纸，按纸色谱常规点样，并选用不同溶剂上行展开，最后显色，计算样品的R_f及β值，并据此确定最佳的溶剂系统。

2. 分离方法的确定

液-液萃取法分离化学成分主要有两种操作方法：简单萃取法(即分批萃取法Batchextraction)和逆流分溶法(Counter-CurrentDistribution简称CCD)。前者操作简单，但分离效果较差；后者操作复杂，但分离效果好，可同时分离几种成分组成的多元混合物及性质极为相似的化合物。方法的确定主要依靠β值的大小，一般当β＞50时说明混合物易于分离，在设计方案时可采用简单萃取法；当β＜50时宜用分离效果较高的CCD法。

3. 溶剂用量比的确定

在简单萃取或逆流分溶过程中，溶剂用量比例要合适，这样可以大大提高分离

效果。最适量的溶剂用量比例可由下公式得出：

R=V_有机相/V_水相 = 1/   V：体积

4.逆流分溶转移次数的确定

用逆流分溶法分离混合物时需要的最经济的转移次数N可用下式计算：

N=β[3(α+β)+δ(αβ+1)]²/α(β-1)²

式中α为溶剂因子，可由α=R²·K₁·K₂求出，其值与所达到的分离纯度有关，纯度要求越高，δ值越大(表1)，转移次数N也越大。

表1 δ值与纯度的关系

三、实验内容

1.仪器及试剂

三角瓶若干；分液漏斗100ml1个，50ml 4个；蒸馏装置一套、培养皿、毛细管、试管，纸色谱筒，色谱滤纸，棉花。

洋金花；氯仿；浓盐酸，浓氨水，改良的碘化铋钾试液；柠檬酸-碳酸氢钠缓冲溶液（pH=5、6.5、7.5、8.5)四种；氢溴酸东莨菪碱对照品溶液，硫酸阿托品对照品溶液。

2.实验操作

1)洋金花中总生物碱的提取

称取洋金花(搓碎)15g，置于100ml三角瓶中，加蒸馏水80ml，滴加浓盐酸调溶液pH=2，浸泡过夜。第二天抽滤，将滤液倒入125ml分液漏斗中，加20ml氯仿，用浓氨水碱化至pH=8～9，振摇萃取。再分别用20ml、10ml氯仿分别萃取两次。合并三次氯仿萃取液，水层弃掉，回收氯仿，剩5～6ml即可(留1ml作纸色谱用)。

2)东莨菪碱与莨菪碱的分离

(1) 分离条件的考察  取一条15cm×5cm的色谱滤纸，用铅笔距底端2cm划起始线，再垂直于起始线画三条等距纵线，即将滤纸分为四等分窄条。用棉球沾取不同pH的缓冲液（pH依次为5、6.5、7.5、8.5的柠檬酸-碳酸氢二钠缓冲液)按顺序涂布于滤纸的各条带上，涂布操作要求均匀、快速，而且在尽量避免缓冲液间邻近区间的扩散。涂毕后将湿滤纸条夹在两张干滤纸之间吸去多余的水分。然后用毛细管吸取总生物碱溶液分别点于色谱滤纸各条缓冲带的起始线处。以水饱和的氯仿为展开剂，展开。展开高度约10cm后取出，以改良的碘化铋钾试剂喷雾显色。记录不同pH缓冲带下样品展开的R_f值和β值，根据此值选择样品中生物碱分离的适宜pH缓冲条件。

(2) CCD分离方法(Counter-Current Distribution) 取4个小分液漏斗，编号为1～4，每只内盛有pH=6.5的缓冲溶液5ml做为固定相(缓冲溶液要用氯仿提前饱和)。将含有总碱的氯仿浓缩溶液5ml转入第1号分液漏斗中，振摇后静置分层；之后再将第1号分液漏斗中的氯仿层溶液转入至第2号分液漏斗中，振摇后静置分层；然后再将第2号分液漏斗中的氯仿层溶液转入至第3号分液漏斗中，振摇后静至分层；然后再将第3号分液漏斗中的氯仿层溶液转入至第4号分液漏斗中，静置后分层；最后将第4号分液漏斗中的氯仿层溶液收集至试管中（编号为第1号氯仿萃取液)。

再取5ml新配的氯仿液（提前用pH=6.5的缓冲溶液饱和)倒入第1号分液漏斗中，振摇后静置分层；然后再将第1号分液漏斗中的氯仿层溶液转入第2号分液漏斗中……。最后将第4号分液漏斗中的氯仿层溶液收集至试管中（编号为第2号氯仿萃取液)。重复上步骤工作，依顺序得到编号为第3号、第4号的氯仿萃取液。共得到编号为1～4号的四份氯仿萃取液。

将第1至4号分液漏斗中的水相中各加入5ml氯仿，再分别加入氨水碱化至pH=9，振摇后静置，分出氯仿层溶液，共得到编号为5～8的四份为水相碱化后的氯仿萃取液。将以上各氯仿萃取液（编号1～8，共8份)分别浓缩至小量后待纸色谱鉴定用。

3)纸色谱鉴定

取一张圆形纸色谱滤纸，在圆心处画一直径约为3cm的圆圈做为起始线。用棉球沾取pH=6.5的缓冲溶液均匀涂于一张圆形纸色谱滤纸上，用干滤纸吸去多余的水份，再按圆形纸色谱法操作。

点样：洋金花总生物碱氯仿浓缩液(自提)，氢溴酸东莨菪碱对照品溶液，硫酸阿托品对照品溶液，编号1～4（流动相)、5～8（固定相)的氯仿萃取浓缩液。

展开剂：用pH=6.5缓冲溶液饱和的氯仿液。

显色剂：改良的碘化铋钾试液，喷雾显色。

注意观察各样品斑点情况，并分析各萃取液中的成分。

四、思考题

1. 在提取中为什么要先加氯仿再碱化？碱化后的pH值为什么要控制在8-9？

2. 萃取用的氯仿为什么要用pH=6.5的缓冲溶液饱和？

实验五  一叶萩碱的分离和鉴定

大戟科植物一叶萩（Securinegasuffruticosa(Pall) Rehd)也称叶底珠，别名狗杏条，我国资源十分丰富。其根、叶和嫩枝中均含有多种生物碱，结构已经清楚的有十几种，其中一叶萩碱含量最高，并已用于临床。一叶萩碱和它的衍生物能兴奋中枢神经，增强心肌收缩，升高血压，临床用硝酸一叶萩碱治疗面神经麻痹，小儿麻痹骶神经炎和股外侧神经炎感染引起的多发性神经炎，成为神经科疾患的常见药物。

一、实验目的

1. 掌握用离子交换树脂法提取分离生物碱的原理和方法。

2.了解一叶萩碱衍生物的制备方法及鉴定方法。

二、实验原理（综合性实验)

一叶萩碱为淡黄色棱形晶体，难溶于水，易溶于醇、氯仿，较难溶于石油醚，其结构如下：

一叶萩碱具有较强的碱性，能与酸成盐而溶于稀酸水，将其盐的水溶液通过阳离子交换树脂柱进行交换，交换树脂用浓氨水碱化，再用氯仿提取得到总生物碱。

三、实验内容

1. 仪器与试剂

玻璃色谱柱（21mm×200mm)及配套分液漏斗，烧杯（50 ml，500 ml，1000m1)，渗漉筒，滤纸，纱布，100ml三角瓶，索氏提取器，恒温水浴锅，培养皿、蒸发皿，试管，玻璃板（5×20cm)，色谱缸，滤纸，玻璃漏斗，铁架台， 250ml圆底烧瓶，恒温水浴锅，抽滤瓶，布氏漏斗，冷凝器。

一叶萩，硅钨酸试剂，碘化钾试剂，碘化铋钾试剂，石油醚，氨水，氯仿，苯，乙醇，乙醚无水乙醇，10%硝酸无水乙醇液，无水乙醇，乙醚，碘甲烷，丙酮，甲醇，氧化铝（碱性Ⅱ~Ⅲ，粒度＞200目)。

2. 实验操作

1) 

2)生物碱的定性实验

① 取渗漉液1ml，加硅钨酸试剂数滴，产生淡黄色沉淀。

② 取渗漉液1ml，加碘化钾试剂数滴，产生淡棕褐色沉淀。

③ 取渗漉液1ml，加碘化铋钾试剂数滴，产生棕红色沉淀。

3)一叶萩碱衍生物的制备

  ① 硝酸一叶萩碱的制备

称取一叶萩碱200mg，加6ml乙醚及9ml无水乙醇，使生物碱全部溶解，滴加10%硝酸无水乙醇液14ml，滴加乙醚至浑浊、放置，白色结晶析出后，过滤，结晶用无水乙醇-乙醚（1：1)洗涤数次、干燥，即得硝酸一叶萩碱。

硝酸一叶萩碱、无嗅、味苦，溶于水，难溶于醇。mp 222℃。

② 一叶萩碱的甲基化物的制备

称取样品100mg，碘甲烷（MeI)0.4ml及丙酮10ml水浴回流1h，放冷结晶析出后，过滤，结晶用乙醚洗涤，用MeOH-EtOH重结晶，获得黄色针状结晶，mp. 232℃。

反应式：

4)鉴定

①  TLC  吸附剂：Al₂O₃（碱性Ⅱ~Ⅲ，粒度＞200目)

展开剂：a.氯仿-苯-乙醇 (25:25:2)；b.氯仿；c. 乙醚

② IR ν_max  1790cm^-1（不饱和内酯环上的质子)，1730 cm^-1（内酯的羰基)

1620 cm^-1（双键)

③ UVλ_max  256.6 nm，311.6nm

四、思考题

   1．用树脂提取生物碱的原理是什么？为什么提取生物碱时必须考虑交联度？

   2．用石油醚从树脂上回流洗脱一叶萩碱的原理是什么？

实验六 青蒿素的提取、分离和检识

青蒿素是从中药青蒿中分离得到的一个有抗疟活性的倍半萜过氧化物，尤其对脑型疟疾和抗氯喹疟疾具有速效和低毒的特点。

一、实验目的

1.掌握从青蒿中提取、分离并鉴定青蒿素的方法。

2.学习柱色谱的操作方法

 二、实验原理（综合性实验)

青蒿素（Artemisinin)是低极性的倍半萜过氧化物，因此可以用低沸点的溶剂如二氯甲烷、氯仿、乙醚、丙酮和石油醚(30~60℃)来提取。然后应用层析和重结晶的方法来分离纯化青蒿素。

  青蒿素

三、实验内容

1．仪器和试剂

  色谱柱，旋转蒸发仪，硅胶薄层板，展开缸，显色试剂喷瓶，电吹风，锥形瓶(50m1)等。

青蒿干燥的叶子，100~200目硅胶，石油醚，氯仿，乙酸乙酯，二氯甲烷，正己烷，乙腈(分析纯)，5％香草醛-浓硫酸(硫酸-无水乙醇＝4:1)，

2. 实验操作

1)提取分离方法

 青蒿干燥的叶子(粉碎)用沸点30~60℃的石油醚提取48小时．回收浓缩后得到棕黑色浆状物。再用20m1氯仿溶解后，加入180m1的乙腈，过滤除去不溶部分，滤液减压浓缩得到胶质状残渣。将残渣用200g（100-200目)硅胶进行柱色谱分离，用7.5％乙酸乙酯-氯仿作为洗脱剂。从洗脱剂下来200m1之后开始收集流分，每瓶流分体积为40ml。流分用TLC进行检测。收集流分体积约300m1后，青蒿素被洗脱下来，为白色结晶。用二氯甲烷-正己烷(1:4)重结晶可得到青蒿素纯品。

2)TLC鉴定

样品：青蒿素的氯仿(或二氯甲烷)溶液

展开刑：7.5％乙酸乙酯：氯仿

显色： 用5％香草醛—浓硫酸，可以观察到青蒿素开始为黄色斑点，加热后变成紫红色斑点(R_f=0.66)。

注意事项：高温易导致青蒿素产生大量降解产物，因此本实验必须低温提取回收，温度不得超过60℃。

四. 复习题

1. 提取时为何使用乙腈？

2. 设计青蒿素提取分离的其它方法？

实验七 穿心莲内酯的提取、分离、鉴定及亚硫酸氢钠加成物的制备

  穿心莲为爵床科植物穿心莲(Andjrographis panicalata (Burmf)Ness)的全草或叶。具清热解毒，凉血消肿作用，用于治疗急性菌痢、胃肠炎、咽喉炎、尿路感染等。穿心莲中含有多种苦味素，属二萜类化合物，主要为穿心莲内酯、脱氧穿心莲内酯、高穿心莲内酯、新穿心莲内酯、穿心莲烷、穿心莲酮等。其中穿心莲内酯、新穿心莲内酯是穿心莲抗菌消炎的主要有效成分。鉴于穿心莲内酯在水中的难溶性，将穿心莲内酯进行磺化、亚硫酸氢钠加成和琥珀酸酐酯化等水溶性衍生物合成研究，克服了穿心莲内酯不溶于水的特性。

穿心莲中主要成分的结构及其性质

 1．穿心莲内酯(andrographolide)：C₂₀H₃₀O₆，又称穿心莲乙素，为无色方型或

长方型结晶，mp 230~232℃，[a]_D²⁰ -126^。。味极苦，可溶于甲醇、乙醇、丙酮、吡啶，微溶于氯仿、乙醚，难溶于水及石油醚。

 2．脱氧穿心莲内酯(14-deoxy-andrographolide)：C₂₀H₃₀O₄，又称穿心莲甲素，为无色片状或长方型结晶， mp l75~176.5℃，[a]_D -36(1％，氯仿)。味稍苦，可溶于甲醇、乙醇，丙酮、吡啶、氯仿、乙醚、苯、微溶水。 

 3．新穿心莲内酯（neo-andrographolide )：C₂₆H₄₀O₈，又称穿心莲丙素、穿心莲新苷，为无色柱状结晶，mp l67~168℃。无苦味，可溶于甲醇、乙醇、丙酮、吡啶，微溶于氯仿和水，不溶于石油醚。

穿心莲内酯 脱氧穿心莲内酯 新穿心莲内酯

一、实验目的

1. 掌握穿心莲内酯类二萜化合物的理化性质和提取分离方法。

2. 学习氧化铝柱色谱的原理和操作方法。

3. 通过穿心莲内酯亚硫酸氢钠加成，掌握使脂溶性产物转化为水溶性产物的一种方法。

二、实验原理（综合性实验)

穿心莲中的内酯类化合物易溶于甲醇、乙醇．丙酮等溶剂，故利用此性质选用乙醇提取之，穿心莲中含有大量叶绿素，可用活性炭脱色法除去叶绿素类杂质；利用穿心莲内酯与脱氧穿心莲内酯在氯仿中溶解度不同，初步将二者分离；利用穿心莲内酯与脱氧穿心莲内酯结构上的差异，用氧化铝柱分离二者，将穿心莲内酯制成亚硫酸氢钠加成物以增加其在水中的溶解性。

三、实验内容

1．仪器和试剂

玻璃色谱柱（2×30cm)及配套分液漏斗，滤纸，50ml三角瓶数个， 恒温水浴锅，蒸发皿，玻璃板（5×20cm)，色谱缸，玻璃漏斗，铁架台，500ml园底烧瓶，抽滤瓶，布氏漏斗，冷凝器，旋转蒸发仪，硅胶薄层板，显色试剂喷瓶，电吹风，锥形瓶(50m1)等。

穿心莲粗粉，95％乙醇，活性炭，丙酮，氯仿，甲醇，正丁醇，亚硫酸氢钠，无水乙醇，0.3％亚硝酰铁氰化钠，10％的正丁醇氢氧化钠溶液，3，5-二硝基苯甲酸碱性溶液，50％氢氧化钾甲醇试液。

2. 实验方法

 (一)内酯类成分的提取

1)提取：称取穿心莲粗粉100g，置圆底烧瓶中，加95％乙醇以浸过药粉2cm为度，回流1小时，过滤，药渣再加适量乙醇回流2次，每次1小时，过滤，合并三次滤液，回收乙醇至总体积的1/5量，放冷，即为内酯类成分总提取物。

2)脱色：将上述内酯类成分总提取物加入原料量的15~30％活性炭，加热回

流30分钟，脱色后的溶液再浓缩至15~2ml左右，放置析晶。

 (二)分离、精制

 1)穿心莲内酯的分离结晶法，将活性炭脱色后的浓缩液放置析晶，滤取结晶，并用少量水洗涤即得穿心莲内酯粗品(含少量脱氧穿心莲内酯)。母液待分离脱氧穿心莲内酯。

 2)穿心莲内酯的精制将粗品穿心莲内酯结晶加40倍量丙酮，加热回流l0分钟，过滤不溶物再加20倍量丙酮，加热回流l0分钟，过滤，合并二次丙酮液，回收丙酮至三分之一量，放置析晶，滤取白色颗粒状结晶，即为穿心莲内酯精品。做薄层鉴定。

 3)脱氧穿心莲内酯分离

将结晶法析出的穿心莲内酯母液水浴蒸发至稠膏状，再加氯仿70ml，尽力搅拌后滤出氯仿层，残渣再加氯仿10ml同法处理。合并二次滤液，水浴回收至5ml，将此浓缩液上氧化铝柱(2×30cm)。用中性氧化铝约30~35g，氯仿湿法装柱，用氯仿洗脱，控制流速为2~3ml/分，每份10ml，约收12~15份。各流份浓缩后簿层鉴定，合并相同流份，蒸干氯仿，用丙酮结晶二次，得白色结晶即为脱氧穿心莲内酯，做薄层鉴定。

(三)穿心莲内酯亚硫酸氢钠加成物的制备

取穿心莲内酯精制品0.5g置50ml圆底烧瓶中，加95％乙醇5ml及计算量的4％的亚硫酸氢钠水溶液，加热回流30分钟，反应液蒸出乙醇，再加5mJ水溶解，冷却后过滤，滤液用少量氯仿洗涤三次，水液浓缩至干。残留物加乙醇l0~20ml溶解，滤除不溶物，乙醇溶液浓缩放置或抽松，得白色粉末。粗品用乙醇-氯仿重结晶得到穿心莲内酯亚硫酸氢钠加成产物。

 (四)鉴定

 1)穿心莲内酯的鉴定：

(1) 物理常数：mp 230~232℃。

(2) 薄层色谱： 吸附剂：硅胶G-CMC。展开剂：氯仿-无水乙醇(20:1)。

显色剂：碘蒸气。结果：穿心莲内酯在常量下为一个斑点。

(3) 显色反应：

①亚硝酰铁氰化钠碱液反应(Legal 反应)：取穿心莲内酯结晶少许放在比色板上，加乙醇0.2ml溶解，加0.3％亚硝酰铁氰化钠溶液2滴10％的氢氧化钠溶液2滴。

②3，5-二硝基苯甲酸碱液反应(Kedde 反应)： 取穿心莲内酯结晶少许，于比色板上，加乙醇0.2ml溶解，加3，5-二硝基苯甲酸碱性溶液2滴，呈紫色。

③50％氢氧化钾甲醇试液反应：穿心莲内酯遇氢氧化钾甲醇溶液呈紫色。

2)脱氧穿心莲内酯的鉴定：

  (1) 测熔点：mp l75~ 176.5 ℃。

   (2) 薄层鉴定：条件同穿心莲内酯。

3)穿心莲内酯亚硫酸氢钠加成物的鉴定：

  (1) 测熔点：mp 226~227℃。

   (2) 薄层鉴定：吸附剂，硅胶G-CMC板。

   展开刑：A.氯仿-甲醇(9:1)，B.氯仿-正丁醇-甲醇(2:1:2)，C.氯仿-丙酮-乙醇-水(5:5:5:1)。显色剂：3、5-二硝基苯甲酸碱性溶液 。

   样品：①穿心莲内酯乙醇液  ②穿心莲内酯亚硫酸氢钠加成物。

   结果：用展开剂A，样品②留在原点、用展开剂B、C，样品①移至前沿，样品②R_f值在0.5左右。

四、复习题

   1. 根据穿心莲内酯类成分的不同结构，判断各自的极性大小，分析出各成分在薄层板上的R_f值。

   2．试说明穿心莲内酯显色反应的机理。

实验八  黄芩苷的提取分离

（ 设计性实验)

一. 概述

   黄芩苷是中药黄芩中具有抗菌作用的主要有效成分，对革兰氏阳性和阴性细菌有抑制作用，临床上用于上呼吸道感染，急性扁桃腺炎、急性咽炎、肺炎及痢疾等疾病。近年来报导用以治疗肝炎，有降低转氨酶的作用，如市售中成药银黄口服液、银黄片中的主要成分之一是黄芩苷。

   黄芩为唇形科植物黄芩(Scutellaria baica lensls Georg．)的根。从黄芩医学招聘网根中提

取分离出的黄酮类成分有6种，黄芩素(5，6，7-三羟基黄酮)及其苷(C7-葡萄糖醛

酸)、汉黄芩素(5，7-二羟基-8-甲氧基黄酮)及其苷(C7-葡萄糖醛酸)、7-甲基黄芩素及5，8-二羟基-7-甲氧基黄酮．其中以黄芩苷(Baicalin)含量最高，而汉黄芩素(Wo

gonln)则是我国黄芩中所特有的成分。

二. 实验目的

1. 学习查阅天然药物化学主要文献资料的方法

2．通过分析文献资料结合所学知识，自己设计并实施提取分离黄芩苷，并进行结构鉴定的方法，以提高学生独立思考和解决问题的能力。

三. 文献综述

要求学会系统查阅国内外文献的方法，有详细的阅查记录及资料，后写出综述，综述内容如

1．黄芩的植物来源、品种、科属及分布

2．黄芩苷的临床应用和药理活性研究概况。

3．黄芩中主要化合物的名称、熔点、结构、理化性质、提取分离方法、结构鉴定手段。

四. 提取分离方法设计  

1．根据文献资料及所学有关知识简述提取纯化分离黄酮类化合物的方法。

2．设计提取纯化黄芩苷方法 。

3．列出所需实验材料的名称及规格，并安排实验进度。

五. 黄芩苷的结构鉴定

1．简述检查一个化合物纯度的方法，黄酮结构鉴定程序，用化学和波谱方法确定其结构的途径。

2．根据黄芩苷的结构提出鉴定其结构的具体方案。

3．将各方案于全组讨论，优选好的方案进行实验。

六. 总结与讨论 

附录一   常用试剂的配制及使用方法

一、生物碱沉淀试剂

1. 碘化铋钾试剂（Dragendorff试剂)

溶液Ⅰ：0.85g次硝酸铋溶于10ml冰醋酸与40ml水中。

溶液Ⅱ：8g碘化钾溶于20ml水中。

制备液：溶液Ⅰ与Ⅱ等体积混合，可于棕色瓶中保存较长时间，一般制备液可作为沉淀剂用。

喷雾剂：1ml制备液和2ml醋酸及10ml水临用前混合即得。生物碱和某些含氮化合物显桔红色斑点。

2. 碘化汞钾试剂（Mayer试剂)

制备液：1.36g氯化汞和5g碘化钾各溶于20ml水中，等体积混合后稀释至100ml。

显色剂：制备液加1/10体积的17％盐酸。

3. 碘-碘化钾试剂（Wager 试剂)

  1g碘和10g 碘化钾溶于50ml水，加热，加2ml冰醋酸，用水稀释到100ml。

4. 硅钨酸试剂（Bertrand 试剂)

5g硅钨酸溶于100ml水中，加10％盐酸至pH2左右。

5. 磷钼酸和磷钨酸试剂

显色剂：5~10％的磷钼酸或磷钨酸的乙醇溶液。喷洒后120℃加热。

沉淀剂：磷钼酸钠20g溶于硝酸中，加水使成10％溶液。

二、酚类检识试剂

1.三氯化铁试剂：1~5％三氯化铁的水溶液或乙醇溶液，并加少许盐酸。

2. 铁氰化钾－三氯化铁试剂：

溶液Ⅰ：2％铁氰化钾水溶液

溶液Ⅱ：1％三氯化铁水溶液

临用前溶液Ⅰ与溶液Ⅱ等体积混合。

3.  4-氨基安替比林-铁氰化钾试剂（Emerson反应)

   喷雾剂Ⅰ：2% 4-氨基安替比林乙醇溶液

喷雾剂Ⅱ：8％ 铁氰化钾水溶液

先喷溶液Ⅰ，再喷溶液Ⅱ后，将薄层板放于含有25%氨水的密闭容器中显红橙色～淡红色。

4. Gibb’s试剂：溶液Ⅰ：0.5％2，6-二溴（氯)苯醌－氯亚胺乙醇溶液。

溶液Ⅱ：硼酸－氯化钾－氢氧化钾缓冲液（pH9.4)

三、内酯、香豆素类的试剂

 1.异羟肟酸铁试剂：

溶液Ⅰ：7％盐酸羟胺甲醇溶液。

溶液Ⅱ：10％氢氧化钾甲醇溶液。

溶液Ⅲ：1g三氯化铁溶于1％盐酸100ml中。

试管反应时先加Ⅰ、Ⅱ，然后再加Ⅲ。

作显色剂时将Ⅰ、Ⅱ两液按1:2比例混合，过滤，用滤液喷洒，再喷洒溶

液Ⅲ。

四、黄酮类检识试剂  

1. 氨气

2. 氢氧化钾试剂：10％氢氧化钠或氢氧化钾水溶液

3. 1％或5％碳酸钠溶液

4. 三氯化铝试剂（Aluminum chloride)：1％或5％三氯化铝的乙醇溶液。

5. 醋酸镁试剂：0.5～2％醋酸镁的甲醇溶液。

6. 锆－枸橼酸试剂：

试剂Ⅰ：2％的二氯氧锆（ZrOCl₂)甲醇溶液。

试剂Ⅱ：2％的枸橼酸甲醇溶液。

使用时分别加入试剂Ⅰ和Ⅱ。

7. 三氯化锑试剂：10％三氯化锑的氯仿溶液，100℃烤5分钟。

五、蒽醌类检识试剂

1. 氨气

2. 氢氧化钾试剂：10％氢氧化钾水溶液。

3. 醋酸镁试剂：5％醋酸镁甲醇溶液。

4. 1％硼酸试剂：1％硼酸水溶液。

六、强心苷类检识试剂

1. 3，5二硝基苯甲酸（Kedde)试剂

溶液Ⅰ：2％3，5二硝基苯甲酸甲醇溶液。

   溶液Ⅱ：1mol/L氢氧化钾甲醇溶液或5％氢氧化钠乙醇溶液。

   应用前试剂Ⅰ、Ⅱ等量混合。强心苷显紫红色，几分钟后退色。

2. 亚硝酰铁氰化钠－氢氧化钠（Legal)试剂

  溶液Ⅰ：0.5％亚硝酰铁氰化钠水溶液。

溶液Ⅱ：10％氢氧化钠溶液。

检识反应时，先将样品蒸干，溶于吡啶，加溶液Ⅰ，摇匀后再加溶液Ⅱ。

3. 碱性苦味酸（Baljet)试剂

溶液Ⅰ：3.6％苦味酸甲醇溶液。

  溶液Ⅱ：1％氢氧化钠溶液。

  使用时溶液Ⅰ和溶液Ⅱ以10:1混合。

4. 氯胺T－三氯醋酸试剂

 3％氯胺T水溶液及25％三氯醋酸的乙醇液以1:4混合。临时用新配。

七、皂苷类检识试剂

1.醋酐-浓硫酸（Liebermann)试剂

溶液Ⅰ：醋酐

溶液Ⅱ：浓硫酸

样品蒸干溶于醋酐，沿管壁小心加入浓硫酸。

2.磷钼酸试剂：25％磷钼酸乙醇溶液，喷雾后140℃加热5～10分钟，皂苷元均呈深蓝色。

3.10％硫酸乙醇溶液

八、萜和甾体类化合物的试剂

1. 香草醛-浓硫酸试剂 5％香草醛-浓硫酸液或0.5g香草醛溶于100ml硫酸-乙醇（4:1)中。

2. 三氯化锑试剂  25g三氯化锑溶于75g氯仿中。

3. 三氯醋酸试剂  3.3g三氯醋酸溶于10ml氯仿，加入1~2滴过氧化氢溶液。

九、糖类检识试剂

1. α-萘酚－浓硫酸（Molish)试剂

1g α-萘酚溶于10ml乙醇中。

在试管中加1~2滴α-萘酚醇液，沿壁缓慢加浓硫酸1ml，界面处有紫环，即为糖的正反应。

2. 茴香醛－硫酸试剂

浓硫酸1ml加到含茴香醛0.5ml的乙醇溶液50ml中，需临用前配制。喷雾后100～105℃烤，各种糖显不同颜色。

3. 苯胺－邻苯二甲酸试剂

将0.93g苯胺和1.66g邻苯二甲酸溶于在100ml水饱和的正丁醇中。喷雾后105℃加热10分钟。

4. 碱性酒石酸铜（Fehling)试剂

试剂Ⅰ：硫酸铜结晶6.23g，溶于100ml水中。

试剂Ⅱ：酒石酸钾钠结晶34.6g，氢氧化钠10g溶于100ml水中，贮存于具塞的试剂瓶中。使用时Ⅰ、Ⅱ两液等量混合。

5. 氨性硝酸银（Tollen)试剂：

硝酸银1g加水20ml溶解，注意滴加适量的氨水，随加随搅拌，至开始产生沉淀将近全溶为止，过滤。

6. 三氯化铁－冰醋酸（Keller－Killiani)试剂

试剂Ⅰ：1％三氯化铁溶液0.5ml，加冰醋酸至100ml。

试剂Ⅱ：浓硫酸  使用时分别加入两液。

7. 呫吨氢醇－冰醋酸（Xanthydrol)试剂

10mg呫吨氢醇溶于100ml冰醋酸（含1％的盐酸)中。

十、有机酸检识试剂

1. 溴甲酚紫试剂  蓝色背景上显黄色。

   溴甲酚绿0.04g溶于50％乙醇100ml，用0.1N氢氧化钠溶液调至pH10.0。

2. 溴酚蓝试剂  0.04％溴酚兰乙醇溶液，用0.1N氢氧化钠溶液调至微碱性。

十一、氨基酸检识试剂

茚三酮（Ninhydrin)试剂

0.3g茚三酮溶于正丁醇100ml中，加醋酸3ml或0.2g茚三酮溶于100ml乙醇或丙酮中。喷雾后加热至出现颜色。

附录二  常用有机溶剂的性能

1．甲醇 Methanol（Methyl alcohol   MeOH )CH₃OH

  无色易挥发易燃的液体，能与水和多种有机溶剂如醇类、乙醚、苯等混溶，易被氧化或脱氢而成甲醛，常用作溶剂或色谱展开剂。

   注意：甲醇蒸气与空气形成爆炸性化合物，爆炸极限6.0～36.5％（体积)。甲醇引起晕厥、抽搐，神经的损害以及视力障碍和失明，饮后能致目盲。

2．乙醇 Ethanol（Ethyl alcohol  EtOH)CH₃CH₂OH

   无色透明易挥发和易燃然烧的液体，溶于水及各种醇、乙醚、苯、氯仿、石油醚等有机溶剂，有吸湿性，乙醇对很多化合物溶液度较好，为一种常用溶剂。

   注意：乙醇蒸气和空气混合能析出爆炸性混合物，爆炸极限3.5～18％（体积)。

3．丙酮  Acetone（Me₂CO)CH₃COCH₃

   无色易挥发易燃的液体，有微香气味，能与水、甲醇、乙醇、乙醚、氯仿、吡啶等混溶，对有机化合物溶解度较好，为常用溶剂。

注意：丙酮蒸气和空气混合能析出爆炸性混合物，爆炸极限2.55～12.8％（体积)。

4．三氯甲烷（氯仿)Chloroform  CHCl₃ 

无色透明易挥发的液体，稍有甜味。不易燃烧。微溶于水，溶于乙醇、乙醚、苯、石油醚等有机溶剂，对有机化合物溶解度较好，为常用溶剂。

注意：氯仿不能与金属钠接触，因为有爆炸的危险。氯仿主要作用于中枢神经系统，有麻醉作用，长期接触氯仿可引起肝脏损害。

5．乙酸乙酯（醋酸乙酯) Ethyl  acetate（EtOAc)CH₃COOCH₂H₅

   无色可燃性液体，有果子香气，易燃，微溶于水，溶于乙醇、氯仿、乙醚和苯等，遇碱加温水解，常用作溶剂及抽提黄酮类等成分的萃取剂。

注意：乙酸乙酯蒸气和空气混合能析出爆炸性混合物，爆炸极限2.2～11.2％（体积)。

6．乙醚Ether （Et₂O)C₂H₅OC₂H₅
   易燃易流动的无色透明液体，难溶于 水，遇乙醇、石油醚、氯仿等有机溶剂能任意比例相溶。常用作溶剂及抽提脂溶性成分的萃取剂。

   注意： 乙醚极易挥发和着火。蒸气和空气混合能析出爆炸性混合物，爆炸极限1.85～36.5％（体积)。蒸气能使人失去知觉甚至死亡。

7．苯 Benzene C₆H₆

无色易挥发易燃烧的液体,有芳香气味。不溶于水,溶于乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂。

注意： 苯蒸气和空气混合能析出爆炸性混合物，爆炸极限1.5～8.0％（体积)。苯的毒性主要是对造血系统的损害，早期中毒表现为白细胞数的持续降低和头晕、乏力等。

8．石油醚 petroleum ether

   石油醚是低分子量的烃类（主要是戊烷和己烷)的化合物，和汽油相同，只是比汽油所含杂志少，组分较简单。无色澄清，有象乙醚的气味。不溶于水，溶于大多数有机溶剂，对脂类成分溶解度大。实验室使用石油醚沸点范围分为30～60℃（称petroleum ether)60～90℃（称petroleum benzine)90～120℃（称ligroin)。

注意：容易挥发和着火。

9．正丁醇 n-butyl alcohol(n-BuOH) CH₃CH₂CH₂CH₂OH

无色液体，有酒的气味。微溶于水，溶于乙醇和乙醚，用作溶剂和脱水剂及分离水溶性成分的萃取剂。

注意：蒸气和空气形成爆炸性混合物，爆炸极限3.7～10.2％（体积)。

10．己烷(正己烷) Hexane  CH₃(CH₂)₄CH₃

无色挥发性液体。有微弱的特殊气味。极易挥发着火。不溶于水，溶于乙醇、氯仿、丙酮和乙醚。用作溶剂、展开剂，特别适用于萃取植物油。在60～70℃沸程的石油醚中，主要为正己烷，因此在许多方面可以用该沸程的石油醚代替正己烷作溶剂。

注意：己烷和空气混合物的爆炸极限1.8～8％（体积)。

11．二氯甲烷 Dichloromethane  CH₂Cl₂

  无色透明挥发性液体。有刺激性芳香气味。蒸气不燃烧。微溶于水，能与醇、醚混合。主要代替易燃的石油醚、乙醚。

注意：二氯甲烷蒸气与空气形成爆炸性混合物，爆炸极限6.2～15.0％（体积)。不能用金属钠干燥，否则有爆炸的危险。

12．甲苯 Toluene  C₆H₅CH₃

无色易挥发性液体，有芳香气味。难溶于水，溶于乙醇、乙醚和丙酮。用作溶剂或色谱用展开剂。

注意：蒸气与空气形成爆炸性混合物，爆炸极限1.2～7.0％（体积)。毒性同苯。

13．乙酸（醋酸) Acetic acid （HAc)CH₃COOH

无色澄清液体，有刺激性气味。溶于水、乙醇和乙醚。无水的醋酸在低温下似固体块状，俗称冰醋酸。普通的醋酸约含纯醋酸36％，常用作纸色谱的展开剂。

注意：醋酸与空气混合物中含量超过4％ （体积)时可引起爆炸。醋酸碰到皮肤产生水疱。

14．甲酸（蚁酸)  Formic acid  HCOOH

无色而有刺激性的液体，溶于水、乙醇、乙醚和甘油。有还原性，易被氧化成水和二氧化碳。常作色谱用展开剂。

注意：甲酸有强烈腐蚀性，能刺激皮肤起泡。

15．吡啶（氮杂苯) Pyridine

无色或微黄色液体，有特殊气味。溶于水、乙醇、乙醚、苯、石油醚和动植物油。是许多有机化合物的优良溶剂。

注意：蒸气与空气形成爆炸性混合物，爆炸极限1.8～12.4％（体积)。吡啶对皮肤有刺激作用，可引起湿疹样的皮肤损害。吸入吡啶蒸气可出现头晕、恶心和肝肾损害，大量吸入能麻痹中枢神经系统。

16．甲酰胺  Formanide  HCONH₂

无色澄清油状液体，溶于水、低级醇和二元醇，不溶于烃类和乙醚。油吸湿性。与醇类共热成甲酸酯，常用作溶剂或聚酰胺柱色谱时洗脱剂。

注意：甲酰胺不能用硫酸钙干燥，因能被溶解，溶液程胶状。

17．二甲基甲酰胺 Dimethyl  Formanide  HCON（CH₃)

无色液体。有氨的气味。与水和大多数有机溶剂可任意混溶。化学和热稳定性良好，对有机和无机化合物的溶解范围广，常用作溶剂和聚酰胺柱色谱分离黄酮类成分的洗脱剂。

注意：应避光保存，否则会慢慢分解为二甲胺和甲醛，二甲基甲酰胺属低毒类物质。对皮肤和粘膜有轻度刺激作用，并能经皮肤吸收。

18．乙腈（甲基氰) Acetonitrile CH₃CN

无色液体，有芳香气味。乙腈和水、醇及乙醚可任意混溶。

注意：乙腈有毒、常含有相当多的游离氢氰酸，这是其危险的主要原因。

19．二甲亚砜 Dimethyl Sulfoxide  (CH₃)₂SO

无色、无臭微带苦味的强吸湿性液体。在常压下加热至沸腾可部分分解。能溶于水，溶于乙醇、丙酮、乙醚、苯和氯仿。

注意：二甲亚砜与某些物质如氰化钠、高氯酸镁等混合时可能发生爆炸。

20．环己烷 Cyclohexane CH₂(CH₂)₄CH₂

无色液体。不溶于水,当温度高于57℃，能与水、乙醇、甲醇、苯、醚、丙酮等混溶。

21. 四氢呋喃 Tetrahydrofuran CH₂(CH₂)₂CH₂O

   无色透明液体，有乙醚气味。溶于水和多数有机溶剂。易燃烧，在空气中能形成爆炸性过氧化物。

常用溶剂的物理常数