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医学微生物学-电子教材:病毒的形态与结构

医学微生物学:电子教材 病毒的形态与结构:病毒的形态与结构第一节 病毒的大小与形态  完整的成熟病毒颗粒称为病毒体(virion),是细胞外的结构形式,具有典型的形态结构,并有感染性。病毒体大小的测量单位为纳米(nanometer,nm,为1/1000?m)。各种病毒体大小差别悬殊,最大约为300nm,如痘苗病毒;最小约为30nm,如脊髓灰质炎病毒、鼻病毒等。多数病毒呈球形或近似球形,少数可为子弹状、砖块状,噬菌体可  呈蝌蚪状。经用磷钨
 

病毒的形态与结构

 
 

第一节 病毒的大小与形态


  完整的成熟病毒颗粒称为病毒体(virion),是细胞外的结构形式,具有典型的形态结构,并有感染性。病毒体大小的测量单位为纳米(nanometer,nm,为1/1000?m)。各种病毒体大小差别悬殊,最大约为300nm,如痘苗病毒;最小约为30nm,如脊髓灰质炎病毒、鼻病毒等。多数病毒呈球形或近似球形,少数可为子弹状、砖块状,噬菌体可
  呈蝌蚪状。经用磷钨酸负染后,在电子显微镜下可见到病毒表面的微细结构。简单的病毒可被结晶后用X线衍射分析病毒的超微结构,根据X线衍射图型可用数学方式处理而推导病毒体的分子构型。
  病毒体的内部为核酸,构成病毒的基因组(genome),是决定病毒遗传、变异和复制的物质。核酸外包有蛋白衣壳(capsid),不仅起保护病毒核酸的作用,还能介导病毒进入宿主细胞并具有抗原性。衣壳是由一定数量的壳粒(capsomere)所组成。根据壳粒排列方式的不同可分为以下几种对称类型:
  螺旋对称型(helicalsymmetry))  壳粒沿着螺旋形的病毒核酸链对称排列。见于大多数杆状病毒、弹状病毒。
  20面体对称型(icosahedralsymmetry)  核酸浓集成球形或近似球形,外周的壳粒排列成20面体对称型。20面体的每个面都呈等边三角形,由许多壳粒镶嵌组成。大多数病毒体三角形面由6个壳粒组成,称为六邻体,在三角形顶角可由5个壳粒组成,称为五邻体。
  复合对称型(complexsymmetry)  病毒体结构较复杂,既有螺旋对称又有立体对称型式。仅见于痘病毒、噬菌体等。
  由于病毒的基因组很小,所编码蛋白质的种类有限,衣壳不是单个蛋白分子而需由许多壳粒组成。壳粒是由少数几种重复的多肽亚单位组成。经测定,用20面立体构成的外壳最为坚固,并且其内部空间容积最大。螺旋对称型衣壳则相对不够坚固,因此其衣壳外尚需另有包膜(envelope)包围。包膜是病毒在成熟过程中穿过宿主细胞以出芽方式向细胞外释放时获得的,故含有宿主细胞膜或核膜成分包括脂质和少量糖类。包膜表面常有不同形状的突起,称为包膜子粒(peplomere)或刺突(spike)。有些20面立体对称型病毒衣壳外也具有包膜。
  病毒的大小及形态在病毒分类中有重要的参考价值,但很少在诊断病毒感染中应用。当标本中病毒含量很高,检测的病毒又有形态学特征,并配备有电镜及有经验的病毒形态专家,观察病毒形态及大小可有重要发现。我国洪涛教授在成人腹泻标本中首次用电镜观察到一定大小的病毒体,并从其衣壳中壳粒排列成轮状,初步认定其为轮状病毒。以后经过进一步用分子生物学技术证实确为轮状病毒,从而在国际上首次发现了成人轮状病毒。
    第二节 病毒的核酸与蛋白质
  一、病毒核酸
  多样性  病毒核酸位于病毒体中心,其化学成分为DNA或RNA,籍此分为DNA病毒和RNA病毒两大类。核酸具有多样性,可以为线型或环型,可为双链RNA、单链RNA、分节段RNA、单链DNA或双链DNA。病毒核酸的大小差别悬殊,微小病毒(parvovirus)仅由5000个核苷酸组成,而最大的痘类病毒则由约4000000个核苷酸组成。病毒核酸携带病毒的全部遗传信息,是病毒的基因组。病毒基因组的序列必须被易感宿主细胞所解码,方可被识别、转录并转译出多种病毒蛋白。病毒核酸作为模板还可在细胞内复制合成子代病毒的基因组,并最终形成完整的子代病毒。因为病毒的生命活性必须在活细胞内方能显示,有学者提出:从本质上看在细胞外处于静止状态的病毒体与质粒DNA及转座子类似,并推测是否三者有着共同起源。
  有内含子  由于病毒的基因组很小,为充分利用其核酸,病毒基因组中的多种基因常以互相重叠形式存在,即编码的几个开放读框(ORF)间有重叠。病毒基因的转录与转译均需在细胞内进行,因此病毒基因组的组成与真核细胞的基因组相似,而不同于细菌等原核细胞的基因组。例如细菌基因组无内含子,但病毒基因组中有内含子,并且转录后剪接和加工。
  克隆与表达  因病毒的核酸是决定病毒的感染性、复制特性、遗传性的基础,近10余年来几乎对所有病毒科的代表病毒种均进行了基因克隆并完成了核苷酸测序。此外,还用定位点突变、缺失突变等研究了病毒基因片段的功能。通过将编码有抗原性与保护性蛋白的基因克隆入表达载体后,可大量表达蛋白并可加以利用,发展为重组疫苗。上述基因组技术在DNA病毒中较易于发展,但在RNA病毒中却遇到了困难。直至运用逆转录酶(依赖RNA的DNA合成酶),以RNA病毒基因为模板,合成了互补DNA(cDNA)后,方可用限制性内切酶对cDNA进行克隆和表达。
  二、病毒蛋白质
  结构蛋白  由病毒核酸编码的病毒蛋白质可分为结构蛋白和非结构蛋白。结构蛋白指的是组成病毒体的蛋白成份,如病毒体的衣壳、基质(matrix)或包膜。对于结构蛋白,可通过差速离心或密度梯度离心沉淀病毒体,再用蛋白分离技术(如SDS-聚丙烯胺凝胶电泳等)进行分离与纯化。例如对脊髓灰质炎病毒衣壳蛋白,经纯化分离,发现仅由4种多肽亚单位所组成。基质蛋白是连接衣壳蛋白与包膜蛋白的部分,一般具有跨膜及锚定(anchor)的功能区。包膜蛋白因是核衣壳成熟时经过细胞的核膜或胞质膜释放时形成的,因此均具有跨膜的功能区,大部分蛋白分子突出在病毒体外,而且是糖蛋白。有些包膜上具有在电镜下可见,并有一定形状的刺突。在流感病毒和人类免疫缺陷病毒中,这些刺突具有重要的抗原性,可诱生机体的体液免疫及细胞免疫应答。
  非结构蛋白  非结构蛋白可以存在于病毒体内,如病毒的酶,但也可能不存在于病毒体内而仅存在于感染细胞内,例如抑制细胞生物合成的蛋白或抑制病毒抗原经组织相容性抗原(MHC)递呈的蛋白等。对于细胞内的病毒蛋白则可用针对不同表位的标记单克隆抗体在感染细胞中进行染色与分析。此外还可用蛋白酶或糖基化抑制物在病毒感染的细胞中进行动态分析,以明确各种非结构蛋白出现的时相和其可能的作用。根据基因的核苷酸序列和对氨基酸的推导,也可利用电脑软件进行对比分析病毒蛋白的功能。非结构蛋白中具有酶功能的蛋白,如逆转录酶、蛋白水解酶、DNA多聚酶、胸腺嘧啶核苷激酶等已作为抗病毒药物作用的靶而备受重视。因为从病毒体中分离、纯化病毒酶获得量很少,对多数病毒酶功能的研究都是通过重组表达而获得病毒的酶。有些非结构蛋白具有转化宿主细胞的作用,其机制或是通过激活细胞的癌基因所致,或是蛋白本身即有此作用。编码直接转化细胞蛋白的基因被称为病毒癌基因。有些病毒的非结构蛋白还具有抗细胞因子或抗细胞凋亡作用。因此非结构蛋白的功能研究对阐明病毒的致病机制有重要价值。
  第三节 病毒的培养与增殖
  一、病毒的培养
  病毒必须在活细胞中方能进行生命活动,因此早期对病毒生物学特性的研究主要通过动物接种(鼠、、犬、牛、猴等)以培养病毒。目前动物接种仅限于研究病毒或毒株的致病性或为确切诊断某种病毒为病原体。个别病毒(如流感病毒)必须在鸡胚中进行分离培养。受精鸡胚的羊膜腔和尿囊腔均可用以分离流感病毒。
  在病毒学的发展史中,利用体外培养的动物组织、胚胎或细胞,分离或培养病毒是突破性的成就。我国病毒学家黄桢祥在30年代研究马脑炎病毒时,发现在体外培养的组织块中加入病毒后,培养液的pH与无病毒的对照培养液有显著差别,提出了有可能利用体外组织培养病毒。在此基础上,Enders在非神经组织培养中成功地培养了脊髓灰质炎病毒,并进一步研制出脊髓灰质炎疫苗。Enders在诺贝尔奖金获得者的报告中还提到了黄桢祥的工作。由于组织培养及以后发展的单层或悬浮细胞培养技术具有便于纯化病毒、可直接观察细胞变化(包括细胞出现病变或转化)、可对病毒的复制过程进行基础性研究、可进行空斑纯化病毒克隆以及可滴定病毒含量等优点,至今细胞培养仍是分离病毒及了解病毒生物学特性和病毒疫苗生产的主要工具。例如当今为消灭小儿麻痹症所应用的脊髓灰质炎病毒疫苗就是用细胞培养法所生产与制备的。
  培养病毒所用的细胞有原代细胞、传代细胞及双倍体细胞等不同种类。原代细胞培养是指自动物或人(来自猝死、疾病或因治疗而流产胎儿的材料)组织直接用蛋白酶消化所获得的细胞,经培养后可贴管壁生长或悬浮生长(如淋巴细胞)。原代细胞对病毒的易感性高,主要作为自标本中分离病毒的工具。传代细胞分为二倍体细胞株和传代细胞系。可连续传代的细胞系或来自肿瘤组织(如HeLa细胞)或来自发生自发转化的原代细胞系(如中国地鼠卵巢细胞系,CHO)。这些细胞系的染色体为多倍体,与正常细胞不同。二倍体细胞则为在体外连续50-60代后仍保持其二倍染色体数目的细胞。经再连续传代,则二倍体细胞逐渐衰老而死亡。这种细胞株多数用人胚肺组织建立,既可用于分离病毒,也是人用疫苗生产中首选的细胞株。在用真核表达基因工程产品时则常用CHO细胞。
  由于建立了细胞培养系统才能开展对病毒复制的研究。病毒的复制过程常伴有一定的形态学与生化的变化,最早观察病毒的复制是从细胞发生形态变化入手。溶细胞型病毒感染细胞后,可出现细胞团缩、裂解和细胞肿大以及数个细胞融合成多核巨细胞或细胞聚集成葡萄串等。将病毒原液作10倍系列稀释后,可对病毒的量进行滴定。常用表达的方式为TCID50(50%tissuecultureinfectivedose),即能在半数细胞培养板孔或试管内引起细胞病变(cytopathiceffect,CPE)的病毒量。例如在判定减毒活疫苗的质量时,常需用所含病毒量作为重要标准。此外还可利用在细胞培养的表面覆盖一层半固体物质的方法,使细胞病变形成空斑,用来纯化毒株。
  二、病毒的增殖
  病毒在易感活细胞内增殖的方式,不同于其他微生物的以二分裂方式繁殖。病毒是以其基因为模板,籍DNA多聚酶或RNA多聚酶以及其他必要因素,指令细胞停止合成细胞的蛋白质与核酸,转为复制病毒的基因组,转录、转译出相应的病毒蛋白,最终释放出子代病毒。这一过程称为一个复制周期。为便于阐述,将这一连续过程分成吸附和穿入、脱壳、生物合成、组装成熟与释放四个步骤介绍,以双链DNA病毒为例。
  吸附和穿入(absorptionandpenetration)  病毒需先吸附于易感细胞后方可穿入。吸附主要是通过病毒的包膜或无包膜病毒衣壳表面的配体位点与细胞表面的特异受体结合所介导。体外培养细胞的受体不一定与体内组织或细胞的受体相同。例如脊髓灰质炎病毒在体外细胞培养中可感染人或猴肾细胞,但在体内主要侵犯的靶细胞是神经系统,其机制尚不明确。研究显示,各种病毒的受体不同。已知脊髓灰质炎病毒的一种衣壳蛋白可与灵长类细胞表面的Ig(免疫球蛋白)家族的蛋白受体结合;HIV包膜糖蛋白gP160的受体是人辅助T淋巴细胞表面的CD4受体,但是病毒可有不止一种细胞受体,而且还有不少病毒受体尚未被确定。病毒体吸附于宿主细胞膜上,可通过数种方式穿入。有包膜的病毒多数通过包膜与宿主细胞膜融合后进入细胞,然后将核衣壳释放入细胞浆内。无包膜病毒一般是通过细胞膜以胞饮方式将该衣壳吞入。
  脱壳(uncoating)  病毒在细胞内必须脱去衣壳,其核酸方可在宿主细胞中发挥指令作用。多数病毒在穿入时已在细胞的溶酶体酶作用下脱壳并释放出病毒的基因组。少数病毒的脱壳过程较复杂。这些病毒往往是在脱衣壳前,病毒的酶已在起转录mRNA的作用。
  生物合成(biosynthesis)  早期病毒基因组在细胞内进行转录、转译需先合成非结构蛋白质,即必须的复制酶和转录、转译一些抑制细胞核酸与蛋白质合成的酶以阻断宿主细胞的正常代谢。然后根据病毒基因组指令,复制病毒的核酸,合成结构蛋白质与一系列的非结构蛋白质。这一阶段并无完整病毒可见,也不能用血清学检测出病毒的抗原,因此曾被称为隐蔽期。这一生物合成阶段的详细过程是通过用生物化学、分子生物学及标记核酸等技术研究的实验结果,综合分析所获得。
  病毒基因组有不同类型。在生物合成阶段,主要根据基因组转录mRNA及转译蛋白质的不同分成6大类型:即双链DNA病毒、单链DNA病毒、单正链RNA病毒、单负链RNA病毒、双链RNA病毒及逆转录病毒。
  1.DNA病毒  人和动物的DNA病毒基因组大多数为双链DNA,例如疱疹病毒、腺病毒。它们在细胞核内合成DNA,在胞质内合成病毒蛋白;只有痘病毒例外,因其本身携带DNA多聚酶,DNA和蛋白质都在胞质内合成。
  双链DNA病毒的复制一般可分为早期及晚期两个阶段,早期阶段病毒先利用细胞核内依赖DNA的DNA多聚酶,转录出早期mRNA,再在胞质内核糖体转译成早期蛋白。这些早期蛋白为非结构蛋白,主要为合成病毒子代DNA所需要的DNA多聚酶和脱氧胸腺嘧啶激酶及多种调控病毒基因组转录和抑制宿主细胞代谢的酶,为病毒核酸的复制提供酶和条件。晚期阶段则为病毒双链DNA通过解链后,利用早期转录、转译的酶等分别以正链DNA和负链DNA为模板,复制出子代DNA。同时病毒DNA转录的mRNA可进入胞质转译出病毒的结构蛋白,包括衣壳蛋白及其他结构蛋白。从DNA病毒复制的全过程,可见随病毒基因组转录和转译的不同阶段,需要不同种类的蛋白参与调控,因此需有不同的mRNA转录与转译,从而使这一过程可有效并有序地进行。在生物合成中,因病毒基因组进入细胞核内,不仅有与细胞染色体基因重组与整合的机会,还有利于病毒在细胞内持续存在、激活病毒或细胞的癌基因。生物合成中,由病毒DNA编码的酶与细胞所提供的酶不同,因此已成为抗病毒药物所针对的“靶”。
  单链DNA病毒种类很少。其生物合成需先合成另一条互补链,与亲代单链DNA形成DNA双链的复制中间体后,然后解链而分别转录与转译。
  2.RNA病毒  人与动物的RNA病毒大多数为单链RNA病毒。RNA病毒的生物合成是极其独特的,因其他生物体的基因组均为DNA。绝大数RNA病毒的生物合成并不需要DNA参与,用去核的细胞进行实验,发现RNA病毒仍可进行生物合成,因此RNA病毒只需在宿主细胞质内合成子代RNA及病毒蛋白质。例外的是流感病毒及个别副粘病毒,它们需要有一个细胞核内的生物合成阶段。实验证明细胞核的mRNA对流感病毒的转录有启动作用。
  单链RNA病毒分为正单链RNA病毒与负单链RNA病毒。正单链RNA病毒的RNA基因组不仅可作为模板复制子代病毒RNA,还同时具有mRNA的功能,可直接附着于胞质的核糖体,转译出病毒的非结构蛋白与结构蛋白。非结构蛋白包括供病毒RNA复制所需要依赖RNA的RNA多聚酶等,结构蛋白则包括衣壳蛋白等。负单链RNA病毒的基因组与正单链RNA病毒基因组相同之处为其基因组RNA也可作为模板复制子代病毒RNA,但不同点为其基因组因为是负链RNA不能直接附着于胞质内的核糖体作为mRNA以转译病毒所需的蛋白质;因此负单链RNA病毒体内必须携带有依赖RNA多聚酶,通过自身内部先转录出核苷酸序列与亲代基因组互补的正链后,才能在核糖体上转译出相应的蛋白质。无论正单链或负单链RNA病毒在复制子代病毒RNA前都需合成另一互补链,成为复制中间型后,再分别解链进行复制。不同点是正单链RNA病毒所合成互补链的RNA多聚酶是由其本身RNA作为mRNA转译所合成;而负单链RNA病毒的RNA多聚酶则是病毒体内所携带的。因多数RNA病毒的合成不进入细胞核内,因此不会出现RNA病毒的整合(逆转录病毒例外)。宿主细胞中并无依赖RNA的RNA多聚酶,因此这一酶可作为抗病毒作用的“靶”。在生物合成中,RNA病毒形成的复制中间型可高效地大量复制,因此RNA病毒增殖一个周期所需时间少于DNA病毒。
  逆转录病毒虽也是单链RNA病毒,但其生物合成过程完全不同。因为这类病毒体带有逆转录酶,可用病毒亲代RNA为模板合成互补的DNA链,从而构成了RNA:DNA中间体。随后,在中间体中的RNA由细胞编码的RNA酶H水解去除的同时,进入细胞核,经细胞的DNA多聚酶作用,以DNA链为模板合成互补的另一条DNA链而成为双链DNA分子。这一双链DNA分子通过整合入细胞的染色体DNA上,成为前病毒(provirus),并可随宿主细胞的分裂而存在于子代细胞内。前病毒还可在核内经细胞的依赖DNA的RNA多聚酶转录出病毒的mRNA与子代病毒的RNA。后者可在胞质核糖体上转译出子代病毒蛋白质。逆转录病毒独特的生物合成过程使其成为第一个被确定的人类肿瘤病毒。人类T淋巴细胞白血病病毒(HTLV-I及HTLV-Ⅱ)就是逆转录病毒。此外,HIV也是逆转录病毒;现有的抗HIV药物之一就是针对逆转录酶的制品。
  装配与释放(assemblyandrelease)  根据病毒的种类不同,在细胞内复制出子代病毒的核酸与蛋白质,在宿主细胞内装配的部位也不同;分别可在胞核内、胞质内、核膜及胞质膜上。无包膜病毒装配成的核衣壳即为成熟的病毒体;有包膜的病毒,装配成核衣壳后以出芽方式释放。释放时可包有核膜或胞质膜而为成熟病毒体。包膜上的脂类来自细胞,可随在不同细胞内增殖而有不同,但包膜的蛋白(包括糖蛋白)则由病毒编码,故具有病毒的特异性与抗原性。
  三、病毒增殖的细胞效应
  病毒在复制过程中阻断或抑制宿主细胞的正常代谢,可致细胞损伤、裂解并释放出大量的子代病毒(如脊髓灰质炎病毒等)。出芽释放的病毒(如疱疹病毒等)虽然不直接裂解细胞,但在体外细胞培养中可因细胞功能及新陈代谢的改变最终导致细胞死亡。有些病毒(如巨细胞病毒)的子代病毒很少释放至细胞外,而是通过细胞间桥,或通过细胞融合方式侵入新的细胞。至于逆转录病毒则一方面可以出芽方式释放子代病毒,一方面还可通过整合有病毒基因的细胞分裂后,将病毒基因传递入子代病毒。至于基因分节段的RNA病毒(如流感病毒等)如何能有效地分别复制各节段并有序地将各节段装配成完整病毒体?通过出芽形式大量释放的乙型肝炎病毒,为何在释放完整病毒的同时过量释放无核酸的包膜抗原颗粒等?都是尚未解决的问题。
  当两种病毒同时感染同一细胞时,可发生一种病毒的增殖抑制了另一种病毒增殖的现象称为干扰现象(interference)。有时同种病毒的不同型或不同株之间也可发生干扰现象。对这一现象机制研究首先考虑的是第一种病毒感染后,宿主细胞表面的受体被结合或细胞发生了代谢途径的变化,从而阻止了另一种病毒的吸附、穿入细胞或生物合成。进一步研究发现,经灭活的病毒也具有干扰作用,这就难以用代谢途径变化来解释。以后发现灭活病毒在细胞中可诱导细胞产生抑制病毒复制的一组蛋白质,被称为干扰素(interferon,IFN)。干扰素的发现启动了一系列细胞抗病毒作用及病毒免疫的研究。
  四、病毒的异常增殖
  病毒进入宿主细胞后,可因病毒本身基因组不完整或发生了变化,以致不能在细胞内完成增殖的全过程和复制出有感染性的病毒体。另一方面,如宿主细胞缺乏病毒复制所需的酶、能量等条件,病毒也不能复制和装配释放成熟病毒体。
  缺陷干扰颗粒  带有不完整基因组的病毒体,称为缺陷病毒(defectivevirus)。当缺陷病毒不能复制,但却能干扰同种成熟病毒体进入细胞则被称为缺陷干扰颗粒(defectiveinterferingparticles,DIP)。过去一度曾设想用DIP作为抗野毒株病毒复制的制剂,然而后来发现DIP具有两面性,即在干扰野毒株的同时,野毒株的完整基因组也可弥补缺陷病毒基因组的不足,辅助缺陷病毒增殖出完整病毒。结果使DIP与野毒株各自有增多及减少的消长动态。在自然界还发现有些种的病毒是天然的缺陷病毒,需要在另一种病毒辅助下方可增殖,如腺病毒伴随病毒,是小的单链DNA病毒,必须有腺病毒辅助方可增殖。这种自然存在的缺陷病毒究竟是如何演变与成熟的,还待研究。
  顿挫感染  因细胞条件不合适,病毒虽可进入细胞但不能复制的感染过程被称为顿挫感染(abortiveinfection)。构成顿挫感染的细胞被称为非容许性细胞(non-permissivecells)。能支持病毒完成正常增殖的细胞则被称为容许性细胞。当病毒感染体内一些不是其正常感染时相应的靶细胞时,这些细胞则是非容许细胞。在非容许性细胞内病毒可以存在,但不完成正常增殖周期。如果条件改变,病毒能经过非容许性细胞介导而进入容许性细胞后,在体内可出现完整病毒的增殖。
第四节  病毒的遗传与变异
  对病毒遗传与变异的研究经历了两个阶段,即传统的遗传学和分子遗传学阶段。由于病毒基因组较简单,其基因数在3~10个之间,每种病毒只有一种DNA或RNA,增殖速度极快,例如单个腺病毒在一个细胞内可产生相当于17代的25万个子代DNA分子,因此最早即用病毒作为研究分子遗传学的工具。
  一、传统遗传学
  病毒传统遗传学的研究主要是用不同表型的病毒变异株之间遗传物质的交换来分析各种病毒基因所编码的生物学功能。常用的病毒为腺病毒、流感病毒和辛德毕斯病毒(Sindbisvirus)等。采用的突变株(mutant)是从自然界分离,或是用紫外线、亚硝酸等理化因子诱发而获得的变异株。
  突变株  突变株需具有容易检测与识别生物学特性:如温度敏感(temperaturesensitive,ts)突变株是指在28~35℃的温度下可以复制,但当温度升至37~40℃则不能复制的突变株;宿主范围突变株指的是改变宿主范围的突变株;此外还有抗原性突变株、致病性减弱及耐药性突变株等。一般突变株指的是因基因改变而发生某些生物特性改变的毒株。当该突变株能较稳定地存在,并可在相应的宿主或细胞中传代与存活,则称为变异株(variant)。由于病毒群体中常同时存在基因组略有不同的病毒体,因此在研究中常利用病毒稀释后在单层细胞形成空斑,经三次纯化而获得纯度高的毒株。
  重组与重配  获得具有不同生物学特征的毒株后,病毒传统遗传学的研究方法是将两个有亲缘关系但生物学不同的性状的毒株感染同种细胞,从而可发生核酸水平上的互www.med126.com/sanji/换而产生兼有两亲本特性的子代。这种由于核酸间的互换而形成子代的过程称为重组(recombination),可以用于DNA病毒或RNA病毒。对于基因分节段的RNA病毒,如流感病毒、轮状病毒等,通过交换RNA节段而进行的重组被称为重配(reassortment)。重配发生的机率可高于基因组为单一分子的其他病毒。
  表型混合  由于病毒增殖过程中,核酸复制与转录、转译合成的病毒蛋白分别在细胞的不同部位进行,因此有时两株病毒共同感染时,并未发生核酸的交换。但当一种病毒核酸被另一种病毒核酸所编码的蛋白衣壳包裹后,也会发生一些生物学特征(如耐药性,嗜细胞性)的改变。这种改变不是遗传型的改变而是表型的混合,经再次传代后,子代病毒的特性将由病毒体的核酸所决定,失去了由表型混合而出现的性状改变。因此在获得有新生物学特性的病毒株时,应通过传代,考验新特性的稳定性,以区别重组体与表型混合。
  传统遗传学所用的方法和技术虽很复杂与繁琐,但在这一阶段研究中对病毒基因及功能的分析提供了有意义的成果。例如已知ts变异株常伴有毒力减弱,我国学者将甲型肝炎病毒感染细胞置于相对低的温度下连续传代,结果筛选出减毒的甲肝病毒株,制备了疫苗,并已用于预防甲型肝炎。此外,重组技术在目前研制以痘苗病毒为载体的多重新型疫苗中也仍被沿用。利用重配来研究流感病毒的分子流行病学和发展疫苗也在进行中。传统病毒遗传学的优点为,将病毒基因改变与生物学特性直接联系,能较快地揭示病毒基因的功能。
  二、分子遗传学
  20世纪70年代末开始了用分子遗传学及克隆技术研究病毒的基因,从而将病毒遗传学推进到分子遗传学阶段。随后开展了对病毒基因组的全面研究,即对病毒的全长基因组分别作克隆与核苷酸测序。我国学者已完成对天坛株痘苗病毒(约0.2Mb)的全基因测序,结果发现与国外痘苗毒株有明显的差异。此外,还完成了我国甲、乙、丙、戊、庚型肝炎病毒株的全基因测序。核苷酸序列分析仅从结构上了解了病毒基因组,因此还需从病毒基因组的开放读框(ORF)推导其中编码蛋白的基因,并分别将基因克隆入表达载体,获纯化蛋白后进行功能研究。由此,可更直接、快速地研究表达基因的结构与功能。应用基因点突变、基因片段缺失、基因片段互换等技术,可更精确地了解基因片段,甚至是单一核苷酸的改变的意义。此外,通过对自然界分离的各种病毒科、属、株的一些基因片段的分析和比较,可以了解基因变异的生物学意义。对病毒基因结构与功能的分子生物学研究,已从理论及应用上促进了病毒学的发展。例如:
  病毒基因结构分析  通过对RNwww.med126.com/shiti/A病毒基因的研究,对甲型流感病毒分析,了解了8个节段编码的蛋白功能,从而可对其编码重要的血凝素抗原进行测序分析,并及时发现带有非人来源(禽、猪)流感毒株血凝素的毒株。通过对丙型肝炎病毒基因组分析,发现有较多的编码非结构蛋白的基因,其中已可确定编码病毒RNA多聚酶基因的序列和位置。
  病毒保护性表位的确定  根据核苷酸序列分析,分别克隆与表达不同的病毒包膜蛋白,经免疫原性研究,可以确定表达保护性抗原的位点,如在乙型肝炎病毒表达中已确定编码表面抗原中的“a”决定簇表位(第120~147为氨基酸)是具有保护性的表位。
  病毒抗原高变区的分析  根据基因分析,HIV的包膜抗原编码区(env)中有易发生突变的高变区,容易逃逸机体的免疫应答。
  与毒力相关的基因编码区分析  狂犬病病毒基因分析发现,编码病毒G蛋白第333位氨基酸若由精氨酸变为谷氨酰胺或异亮氨酸,则病毒在神经细胞中的增殖及扩散力将大大降低。
  耐药性变异分析  临床上应用针对病毒酶的药物后,有时病毒经短暂被抑制后又重新复制。分析病毒酶的基因编码区可发现核苷酸序列的变异与耐药性发生的关系。
  作用于病毒基因的某些细胞蛋白研究  病毒在细胞内复制时常有一些细胞蛋白与某些基因或基因调控区(增强子、启动子)结合,在转录与转译中起作用。分析这些蛋白因子的作用对了解病毒与细胞的相互作用很有价值。
 第五节  病毒的分类
  生物的分类是基于对生物体本质与特性认识基础上所形成的。对病毒分类的原则是:①核酸类型与结构(RNA、DNA、双链、单链、线状、环状、是否分节段);②病毒体的形状和大小;③病毒体的形态结构(衣壳的对称型、有无包膜);④对脂溶剂的敏感性等。1995年国际病毒分类委员会第一次将病毒分为三大类,即在原有的DNA病毒类与RNA病毒类之间新增了DNA和RNA逆转录病毒类。这一新类包括了原属RNA病毒类的逆转录病毒科(HIV属此科)和原属DNA病毒类的嗜肝DNA病毒科(乙型肝炎病毒属此科)。这一新动向突出了逆转录过程,因这两科病毒均有自RNA病毒向DNA病毒的逆转录。这一新类病毒的增加也反映了不仅应重视病毒的基因结构,还应重视其基因的转录及转译蛋白质的过程。由于逆转录过程涉及宿主细胞的有关基因,是研究病毒与细胞互相作用的一个重要环节。从此分类学的变化,可以看出病毒与细胞间的相互作用已上升到病毒学的更重要的地位(表-1)。
  卫星病毒(salelletes)和类病毒(viroids)是一些新的非寻常病毒的致病因子。
  卫星病毒:多数与植物病毒相关,少数与噬菌体或动物病毒相关。如腺病毒的卫星病毒(dependovirus)。卫星病毒可分为两大类,一类可编码自身的衣壳蛋白,另一类为卫星病毒RNA分子(也曾被称为virusoid),需利用辅助病毒的蛋白衣壳。其特点为,是500-2000个核苷酸的单链RNA,与缺陷病毒不同,表现为与辅助病毒基因组间无同源性;复制时常干扰辅助病毒的增殖。
  类病毒:很小的杆状RNA分子,由200-400个核苷酸组成,有二级结构,无包膜或衣壳。在细胞核内增殖,利用宿主细胞的RNA多聚酶Ⅱ进行复制。
  目前认为丁型肝炎病毒是一种特殊的嵌合分子,具有部分卫星病毒及部分类病毒的特性。
  朊粒(prion)曾亦度归属于非寻常病毒的致病因子;但经近年深入研究,不少学者认为不宜列入病毒范畴,其生物学地位待定。


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