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| 实验十一 DNA的电泳及限制性内切酶谱分析 | ||||||||||||||||
【实验目的】 掌握限制性核酸内切酶的作用特点；熟悉DNA限制性内切酶谱分析的基本原理及实验操作技术。 【实验原理】 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease，RE) 是由细菌自身产生的能识别双链DNA分子中的特定碱基序列，并以内切方式水解核酸中的磷酸二酯键的核酸水解酶。它可分为三种类型：Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型，Ⅱ型酶就是通常所指的RE，能识别双链DNA的特异序列，并在这个序列内进行切割，它是基因工程中剪切DNA分子的常用工具酶，被誉为分子生物学家的手术刀。临床上某些遗传病是由于基因的缺失或插入或突变所致，可造成 RE 酶切位点的改变，故当用一定的RE切割时，其切开的片段（分子量)大小与正常人发生差异，通过琼脂糖凝胶电泳分离，可产生不同的电泳图谱，即DNA限制性图谱发生改变，据此可达到基因诊断的目的。 实验可选用价格低廉、酶切效果好的EcoRⅠ（识别位点G↓AATTC)对λDNA 进行酶切，观察RE的特定切割作用及其限制性图谱，理论上可产生分子量分别为21,226bp，7,421bp，5,804bp，5,604bp，4,878bp和3,530bp的片段。 【实验试剂和器材】 1．试剂 ⑴ DNA底物：λDNA或制备的肝组织 DNA 或其它含有EcoRⅠ酶切位点的重组质粒 DNA。 ⑵ 限制性内切酶EcoRⅠ及其缓冲液：购买的限制性内切酶均配有相应的缓冲液，在配套的缓冲液中，该限制性内切酶均可获得接近100%酶切活性。 ⑶ 50×TAE电泳缓冲液：取Tris 24.2g，冰乙酸5.7mL，0.25mol/LEDTA (pH8.0) 20 mL，加蒸馏水至100 mL。1×TAE为配制琼脂糖凝胶及其电泳时的应用缓冲液。 ⑷ 溴酚蓝指示剂溶液（6×上样缓冲液)：称取溴酚蓝（bromophenol blue)100 mg，加双蒸水5mL，在室温下过夜，待溶解后再称取蔗糖25 g，加双蒸水溶解后移入溴酚蓝溶液中，摇匀后定容至 50 mL，加入NaOH 1滴，调至蓝色。 ⑸ 溴化乙锭（ethidium bromide，EB，1 mg/mL)：戴手套谨慎称取EB 20 mg于棕色试剂瓶中，加 20 mL双蒸水，溶解后贮于4℃备用，配制琼脂糖凝胶时每100 mL凝胶加50 μLEB。 ⑹ DNA分子量标准：根据需要购买，一般浓度为0.5 μg/μL。 2．器材 ⑴ 电泳仪及水平电泳槽。 ⑵ 移液器及吸头。 ⑶ 0.5 mL Eppendorf管（EP管)及一次性手套。 ⑷ 锥形瓶、量筒、刻度吸管。 ⑸ 微波炉或电炉。 ⑹ 水平台。 ⑺ 紫外分析仪。 ⑻ 照相机及红色滤光片。 【实验步骤】 1．样品DNA酶切 将酶切缓冲液2 μL，λDNA 5 μg (可用基因组DNA或质粒DNA样品代替)，EcoRⅠ5~10U加至0医.学全在线.5 mL EP管中，加双蒸水至20 μL，加盖，混匀后稍离心，37 ℃水浴反应1h。 2．制备琼脂糖凝胶 按照被分离DNA的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量（见表2-7)。 表2-7 琼脂糖凝胶浓度与分辨 DNA 大小范围的关系
称取 0.8g 琼脂糖倒入锥形瓶中，加入 1×TAE 缓冲液 100 mL，置微波炉或水浴加热至完全熔化，取出摇匀，稍冷却后加50 μL EB染色液，摇匀。 3．灌胶 ⑴ 取洁净的电泳内槽（又称托盘)，用橡皮膏或透明胶带将内槽的两端边缘封好（一定要封严，不能留缝隙)。 ⑵ 将内槽放置于一水平台面上，并插好所需齿数和厚度的样品梳子。 ⑶ 将冷却至60℃左右的琼脂糖凝胶液，缓慢倒入内槽，直至所需厚度，注意不要形成气泡，特别是梳子下，如有气泡可用牙签挑破。 ⑷ 待胶冷却凝固后，小心取出梳子，撕去橡皮膏或透明胶带，将带凝胶的内槽放入电泳槽中，注意凝胶点样端要靠近负极。 ⑸ 加入1×TAE缓冲液至电泳槽，缓冲液刚好没过凝胶表面即可。 4．加样 剪取适当大小的蜡膜（Parafilm膜)，取 6×上样缓冲液1 μL点于膜上数点。取5 μL酶切后的样品，0.5~1 μg未酶切质粒DNA，DNA分子量标准分别与上样缓冲液混匀，将其分别加入凝胶的点样孔内（记录点样顺序及点样量)。 5．电泳 接通电泳槽与电泳仪的电源（检查正、负极，DNA片段是从负极向正极移动)。DNA 的迁移率与电压成正比，电压不超过5V/cm凝胶长度。当溴酚蓝染料移动至凝胶前沿1~ 2cm处，切断电源，停止电泳。 6．观察结果 取出内槽，在紫外分析仪的玻璃平板上小心推出凝胶，通过防护屏或戴防护眼镜观察紫外灯透射的结果，DNA条带处应显出桔红色荧光条带，可观察到酶切与未酶切后的DNA条带的泳动位置。 7．摄影 在镜头前加一块红色滤光片，利用透射紫外光作光源，光圈 2.8，曝光0.5~2s，调准焦距，可拍摄质量较好的凝胶照片，有条件时则使用DNA一次成像仪。 【实验注意事项】 1．本实验可先进行酶切反应，在等待酶切过程的时间间隙灌好琼脂糖凝胶。 2．进行DNA酶切时，要在其最适温度下（大多数为37℃)进行。最好是用每一种酶的专用缓冲液，以达到最佳酶切效果。如遇两种酶进行酶切，应先用低盐缓冲液，后用高盐缓冲液，或一种酶切结束后加TE至 400 μL，再进行酚/氯仿抽提、乙醇沉淀，重新建立第二个酶切反应体系。 3．限制性内切酶一定要在低温（-20℃)下贮存，因含50%甘油，在此温度下一般不会冻结，如发生冻结则表明冰箱温度低于-20℃。新购的大包装限制酶，应先进行分装。每次取用时，应将限制酶移至冰盒内，用完后立即放回-20℃冰箱；每次吸取酶时，应使用新的灭菌吸头，以避免污染。 4．进行大量酶切时，先要确定限制酶的浓度。一般1U限制酶于37℃条件下作用底物DNA 1h以上可切割1μg DNA。一般说来，要用2~3倍的酶量才能保证完全消化，对基因组DNA尤其如此。 5．酶切基因组DNA是否完全，可通过紫外观察结果来判断。如看到DNA片段呈均匀递减的一条区带，加样孔处无大量DNA堆积，则表示酶切完全。 6．对多个样品基因组DNA分别酶切电泳摄影，绘制出多个样品的DNA限制性内切酶图谱，即可分析做出基因诊断。 7．为便于电泳后直接可观察结果，溴化乙锭（ethidium bromide，EB)可在琼脂糖加热熔化时加入。注意：EB是DNA的诱变剂，亦是极强的致癌www.med126.com/jianyan/物，配制和使用过程中要小心，操作时一定要戴手套，用过的手套要及时将其翻过来，让污染有EB的面朝里，有EB的废液和器皿要分别处理好。 【思考题】 1. 结果观察为什么一定要在紫外分析仪下观察？ 2. 琼脂糖凝胶中为什么要加溴化乙锭？能否不加？
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