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药物分析-授课教案:第九章 维生素类药物分析

药物分析:授课教案 第九章 维生素类药物分析:皖南医学院教案首页授课时间:2006.10.31 教案完成时间:2006年09月30日 授课名称: 药物分析 2004年级药学专业本科班 授课时间 2006.10.31 学时 2 授课教师 邹纯才 专业技术职务 副教授 教学班学生数 52 教学目的

皖南医学院教案首页

 

授课时间:2006.10.31     教案完成时间:2006年09月30日  

授课名称:

药物分析

2004年级药学专业本科班

授课时间

2006.10.31

学时

2

授课教师

邹纯才

专业技术职务

副教授

教学班学生数

52

教学目的

及任务

1.了解维生素A、B1、C的结构性质与分析方法的关系;2、熟悉维生素A的三氯化反应鉴别试验、维生素B1的硫色素反应鉴别试验、维生素B1含量测定的非水滴定法及紫外分光光度法、维生素C的与硝酸银反应、与2,6-二氯靛酚反应的鉴别试验、维生素C的2,6-二氯靛酚滴定法测定含量。3. 掌握维生素A含量测定即三点校正法的原理、方法及应用。。

教学内容、步骤及时间分配:

教学内容、步骤:第九章 维生素类药物的分析

复习旧课(3min)

作业解析(5min)

引入新课(2min)

线

 
第一节 维生素A的分析  

一、结构性质 (5min) 

二、鉴别试验 (5min)  

三、含量测定(30min)

课间休息十分钟

第二节 维生素B的分析

一、结构性质 (5min)

二、鉴别试验  (5min)

三、含量测定  (15min)

第三节 维生素C的分析 (15min)

一、结构性质

二、鉴别试验及杂质检查

问题讨论(5min)

作业和习题布置(2min)

归纳总结(3min)

本单元重点

三点校正法的原理、测定方法及其计算

本单元难点

维生素A含量测定――三点校正法的原理

教学方法及准备

板书结合多媒体教学CAI(Powerpoint)

所用教材

《药物分析》,第5版,刘文英主编,人民卫生出版社。

参考资料

1.《药物分析化学学习指导》,李培阳 主编,人民卫生出版社。

2.《中华人民共和国药典》2005年版,国家药典委员会编,化学工业出版社。

教研室审阅意见

(教案续页)

基本内容

注解(进展、辅助

手段和时间分配)

线

 

第九章 维生素类药物的分析

维生素:是维持人体正常代谢机能所必需的一类活性物质,主要用于机体的能量转移和代谢调节。

人体不能合成维生素,须从食物中摄取。

中国药典收载有30余个品种,按溶解度分为

脂溶性维生素:VitA、D2、D3、 E、K1 等 

水溶性维生素:VitB族(B1、B2、B6、B12)

        VitC叶酸(VitM)、烟酸、烟酰胺(Vitpp)

 

         第一节  维生素A的分析

维生素A(vitamin A)包括维生素A1(视黄醇,retinol)、去氢维生素A(dehydroretionl,维生素A2)和去水维生素A(anhydroretinol,维生素A3)等,其中维生素A1活性最高,维生素A2的生物活性是维生素A1的30%~40%,维生素A3的生物活性是维生素A1的0.4%。通常所说的维生素A系指维生素A1,其为一种不饱和脂肪醇,在自然界中主要来自鲛类无毒海鱼肝脏中提取的脂肪油(通称为鱼肝油),其含量高达600000国际单位/克(IU/g),多以各种酯类混合物的形式存在,其中主要为醋酸酯和棕榈酯。目前主要采用人工合成方法提取。

中国药典收载的维生素A是指人工合成的维生素A1醋酸酯结晶加精制植物油制成的油溶液,还收载维生素A胶丸维生素AD胶丸和维生素AD滴丸等。

美国药典收载的维生素A是指维生素A及其醋酸酯、棕榈酸酯混合物的食用油溶液。

英国药典收载的人工合成浓缩维生素A是维生素A醋酸酯、丙酸酯和棕榈酸酯混合物的植物油提取溶液。

  

R : -H  维生素A

-COCH3  维生素A醋酸酯

   -COC15H31  维生素A棕榈酸酯

  

讲授结合多媒体教学

复习旧课(3min)

作业解析(5min)

引入新课(2min)

简介

(教案续页)

基本内容

注解(进展、辅助

手段和时间分配)

线

 
  一、结构与性质

(一)为一个具有共轭多烯侧链的环己烯

1.具有UV吸收

2.存在多种立体异构化合物

  相对生物效价   顺反异构

维生素A   325.5   100%      全反

新维生素Aa   328  75%     2-

新维生素Ab   320.5   24%       4-

执业药师维生素Ac   310.5 15%     2,4-二顺

异维生素Aa   323  21%      6-

异维生素Ab   324     24%     2,6-二顺

3. 易发生脱氢、脱水、聚合反应

Vit A2

Vit A3

鲸醇

  

5min,重点讲解其全反式结构及其不稳定性。

(教案续页)

基本内容

注解(进展、辅助

手段和时间分配)

线

 
   (二)共轭多烯侧链易被氧化

△或有金属离子存在时氧化↑

 

环氧化物

VitA

VitA

 

(三)与三氯化锑发生呈色反应

 

(四)溶解性

不溶于水

易溶于有机溶剂和植物油等

(教案续页)

基本内容

注解(进展、辅助

手段和时间分配)

线

 
  二、鉴别

 

(一)三氯化锑反应

  

   条件:无水乙醇

蓝色

                  

   紫红

(二)UV法(BP(1998))

 

  

λmax为326nm     λmax为350~390nm

一个吸收峰 三个吸收峰

5min,三氯化锑指出其存在不足:专属性差,呈色不稳定。

重点讲解UV法。

(教案续页)

基本内容

注解(进展、辅助

手段和时间分配)

线

 
   VitA

去水VitAVitA3)

 

(教案续页)

基本内容

注解(进展、辅助

手段和时间分配)

线

 
(三)TLC

BP   杂质对照品法 

           显色剂  三氯化锑

USP 显色剂 磷钼酸

    规定斑点颜色和Rf

三、含量测定

(一)UV

维生素A中常含有杂质:立体异构体、氧化产物及光照产物、合成中间体、去氢维生素A( VitA2)、去水维生素A( VitA3)。

三点校正法

1.  条件:

(1)杂质的吸收在310~340nm波长范围内呈一条直线,且随波长的增大吸收度减小;

(2)物质对光的吸收具有加和性。

2.  波长的选择:

(1) l1

VitA的lmax(328nm)

(2) l2   l3

  分别在l1的两侧各选一点

第一法  等波长差法

 

 

 

测定对象  VitA醋酸酯

    

30min,此为本节、本章重点、难点,配合多媒体课件讲解。

(教案续页)

基本内容

注解(进展、辅助

手段和时间分配)

线

 
  第二法  等吸收度法(皂化法)

 

测定对象  VitA

  1. 测定法

(1)基本步骤:

v   第一步   A选择

选择依据:

所选A值中杂质的干扰已基本消除

第二步 

 

注意:

Ø   

C 为混合样品的浓度 

(教案续页)

基本内容

注解(进展、辅助

手段和时间分配)

线

 
   第三步  求效价

换算因数由纯品计算而得:

第四步:求标示量%

 

(教案续页)

基本内容

注解(进展、辅助

手段和时间分配)

线

 
(2)第一法 维生素A醋酸酯

    方法:

判断  是否在326~329nm之间

在326~329nm之间

         是     否       

 

        求算        改用第二法

   并与规定值比较

   规定值   差值 

(教案续页)

基本内容

注解(进展、辅助

手段和时间分配)

线

 
判断差值是否超过规定值的±0.02

   有一个以上超过±0.02   无超过±0.02 

 

 

 

 

计算 A328(校正)   用A328计算

 

 

第二法            第二法

 

    -15%    -3%      0    3%

VitAD胶丸中VitA的含量测定

精密称取本品(规格10000VitAIU/丸)装量差异项下(平均装量0.08262g/丸)的内容物 0.2399g 至250ml量瓶中,用环己烷稀释至刻度,摇匀;精密量取2.0ml,置另一20 ml量瓶中,用环己烷稀释至刻度,摇匀。以环己烷为空白,测定最大吸收波长为328nm,并在下列波长处测得吸收度为

A300: 0.354   A300 /A328  :0.555

A316: 0.561  A316/A328   :0.907

A328: 0.628     A328/A328   :1.000

A340: 0.523      A340/A328   :0.811

A360: 0.216     A360/A328   :0.299

求本品中维生素A的含量?

A300 /A328 : 0.564-0.555=+0.01

A316/A328 :  0.893-0.907=-0.01

A328/A328 :  1.000-1.000=0

A340/A328 :  0.833-0.811=+0.02

A360/A328 :  0.344-0.299=+0.04

(教案续页)

基本内容

注解(进展、辅助

手段和时间分配)

线

 
 

 

(3)第二法  (等吸收度法)

       [ 皂化法、6/7A法 ]

适用于维生素A

第一法无法消除杂质干扰时用此法

 


(教案续页)

基本内容

注解(进展、辅助

手段和时间分配)

线

 
 判断lmax是否在323~327nm之间

 

              是       否

计算    取未皂化样品采用

色谱法纯化后再测定

判断是否大于0.73

         是     否       

 

        求算(校正)   未皂化样品采用色谱法

纯化后再测定

 

 

 

 

     -3%      0      3%

三氯化锑比色法  标准曲线法

 

              λmax 618nm~620nm

优点   简便 快速

        呈色不稳定 (5 ~ 10s内)

        水分干扰   

 缺点  与标准曲线温差≤1℃

        专属性差

三氯化锑有腐蚀性

(教案续页)

基本内容

注解(进展、辅助

手段和时间分配)

课间休息十分钟

线

 
  第二节 维生素B1

 

   HCl

      

         CI

氨基嘧啶环-CH2-噻唑环(季铵碱)

 

一、结构与性质

(一)溶解性

   1、易溶于水

  2、水溶液呈酸性

(二)UV 共轭双键

λmax = 246nm

(三)硫色素反应

 

(四)碱性 嘧啶环 —— 伯氨

       噻唑环 —— 季铵

   1、可与酸成盐

2、与生物碱↓→↓

3、含量测定 —— 非水碱量法

二、鉴别试验

(一)硫色素反应  Ch.P

5min,其中:

结构讲解3min,重点为结构中的伯胺、季胺盐。

性质讲解2min.

5min

(教案续页)

基本内容

注解(进展、辅助

手段和时间分配)

线

 
  

 

 

  

(二)沉淀反应  VitB1

 

(三)其他反应

         (硫元素反应)

       

       (CI反应)

(教案续页)

基本内容

注解(进展、辅助

手段和时间分配)

线

 
三、含量测定

(一)非水溶液滴定法

         

   喹那啶红-亚甲蓝

(紫红→天蓝)

         

(二)UV

              

15min,其中非水溶液滴定法和UV法讲解15min,硫色素法讲解5min。

计算板书讲解

(教案续页)

基本内容

注解(进展、辅助

手段和时间分配)

线

 
   ChP  片剂、注射剂

   A=ELC

(每片)相当于标示量的%=

 

 

 

 

(每ml)相当于标示量的%=

 

 

 

(三)硫色素荧光法

1、原理

计算板书讲解。

(教案续页)

基本内容

注解(进展、辅助

手段和时间分配)

线

 
2、方法与计算

激发波长365nm

   发射波长435nm

       + NaOH + 铁氰化钾 + 异丁醇        S

   对照液

    + NaOH + 异丁醇             d

 

   + NaOH + 铁氰化钾 + 异丁醇       A

   供试液

   + NaOH + 异丁醇             b

  

3、特点

(1)灵敏度高,线性范围宽

(2)代谢产物不干扰,适用于体液分析

 

 

 

第三节 维生素C

L-抗坏血酸

一、结构与性质

(一)溶解性

    1、易溶于水

2、水溶液呈酸性

   (二)强还原性 二烯醇结构

 

    

15min,使用多媒体教学课件讲解

(教案续页)

基本内容

注解(进展、辅助

手段和时间分配)

线

 
    

 

  

                   

有活性 有活性      无活性

    

(三) 具糖的性质  结构与糖类相似

糖类的显色反应

(教案续页)

基本内容

注解(进展、辅助

手段和时间分配)

线

 
   (四)酸性  一元酸

 

C3-OH的 

pKa = 4.17

  

C2-OH

pKa = 11.57

(六)水解反应  与碱反应

 

 

(七) UV特征

 

 

(教案续页)

基本内容

注解(进展、辅助

手段和时间分配)

线

 
   二、鉴别试验

(一)与氧化剂的反应

 

 

1、与AgNO3反应  (ChP2005)

2、与2,6 - 二氯靛酚反应  (ChP2005)

 

  

 

 

(教案续页)

基本内容

注解(进展、辅助

手段和时间分配)

线

 
3、与碱性酒石酸铜反应   USP

 

4、与KMnO4反应

  

(二)糖类的反应  USP

  

(三)UV  BP

0.01mol/L HCl

 

使用多媒体教学课件讲解

问题讨论(5min)

作业和习题布置(2min)

归纳总结(3min)

(教案末页)

小 结

本次课主要讲授了维生素A的含量测定方法----三点校正法(要求同学掌握);维生素B1所特有的专属性鉴别反应----硫色素反应(要求同学熟悉);维生素A、B、C的结构与性质(要求同学加以了解)。

线

 
 

复习思考题

作 业 题

1、维生素A不稳定的原因及其不稳定的因素?

2、三氯化锑用于维生素A鉴别的原理及其所存在的不足。

3、分析维生素A及去水维生素A的紫外吸收光谱。

4、维生素A紫外分光光度法(三点校正法)测定的原理是什么?

5、维生素B1的结构、性质及维生素B1特有的反应是什么?

6、为什么要对维生素C进行铁和铜离子的检查

教 学 效 果

与 分 析

多媒体教学和板书相结合,并结合一定的实例,加深学生对知识点的认识和了解。特别是通过问题讨论,让大家对所学知识进行回顾、讨论,建立一个互动的教学氛围,使同学们掌握本次课的学习内容。效果较好。

皖南医学院教案首页

授课时间:2007.11.1  教案完成时间:2006年09月30日  

授课名称:

药物分析

2004 年级  药学专业 本科班

授课时间

2007.11.1

学时

2

授课教师

邹纯才

专业技术职务

副教授

教学班学生数

52

教学目的

及任务

1、了解维生素D、E结构性质与分析方法的关系;2. 熟悉维生素D含量测定的第一法、维生素E的杂质检查及含量测定;3. 掌握维生素C含量测定的碘量法的原理、注意事项及应用。

教学内容、步骤及时间分配:

教学内容、步骤:第九章 维生素类药物的分析

                复习旧课(3min)

作业解析(5min)

引入新课(2min)

第三节 维生素C的分析 

三、含量测定  (30min) 

线

 
   第四节 维生素D的分析 

一、结构性质  (5min) 

   二、鉴别试验   (5min)

课间休息十分钟

三、杂质检查 (5min)

四、含量测定 (10min)

   第五节 维生素E的分析

  一、结构性质   (5min)

二、鉴别试验   (5min)

三、杂质检查   (5min)

四、含量测定   (10min)

问题讨论(5min);

作业和习题布置(2min);

归纳总结(3min)。

本单元重点

维生素C含量测定的碘量法的原理、注意事项及应用

本单元难点

维生素D含量测定法(第一法)

教学方法及准备

多媒体教学CAI(Powerpoint)

所用教材

《药物分析》,第5版,刘文英主编,人民卫生出版社。

参考资料

1.《药物分析化学学习指导》,李培阳 主编,人民卫生出版社。

2.《中华人民共和国药典》2005年版,国家药典委员会编,化学工业出版社。

教研室审阅意见

(教案续页)

基本内容

注解(进展、辅助

手段和时间分配)

医学考研网

线

 
  第九章 维生素类药物的分析

第三节 维生素C的分析

 三、含量测定

(一)碘量法

1、原理

指示剂 淀粉指示液

 

 

2、方法

取本品约0.2g,精密称定,加新沸过的冷水100ml与稀醋酸10ml使溶解,加淀粉指示液1ml,立即用碘滴定液(0.1mol/L)滴定,至溶液显蓝色,在30秒内不褪。每1ml碘滴定液(0.1mol/L)相当于8.806mg的C6H8O6.

复习旧课(3min)

作业解析(5min)引入新课(2min)

30min

板书计算演示

(教案续页)

基本内容

注解(进展、辅助

手段和时间分配)

线

 
  3、讨论

(1)酸性环境  稀醋酸

   减慢VitC被O2氧化速度

(2)新沸冷H2O 赶走水中O2

(3)立即滴定   减少O2的干扰

(4)附加剂干扰的排除

   片剂 —— 滑石粉 —— 过滤

   注射剂 —— 抗氧剂 ——丙酮、甲醛

 

 

 

 

 

(二)2,6 - 二氯靛酚钠滴定法法

USP  JP

1、原理

2、方法

自身指示终点法

(教案续页)

基本内容

注解(进展、辅助

手段和时间分配)

线

 
  3、讨论

(1)酸性环境 HPO3-HAc

稳定VitC

(2)快速滴定 2min

  防止其他还原性物质干扰

(3)剩余比色测定  

  

 

(4)缺点

不稳定 需经常标定

贮存≤一周

干扰多 氧化力较强

(三)HPLC

1、HPLC的优点

灵敏度高  微量分析

选择性高  干扰少

分离分析同步  快速

2、HPLC法分离VitC常用方法及测定对象 

方法  离子交换色谱法

离子对色谱法

分配色谱法(正、反相)

    对象  制剂、生物样品、果汁

 

 

 

血、尿、组织、细胞等

  

(教案续页)

基本内容

注解(进展、辅助

手段和时间分配)

线

 
例  多种维生素片中VitA、 VitB1、VitB2 、VitB6 、烟酰胺、VitC、VitE的含量测定

   色谱柱  ODS

流动相  A、水 -甲醇(4  :1)

  B、甲醇

 (梯度洗脱)

抗氧剂 二巯基丙烷磺酸钠

  水溶性维生素

    离子对色谱法(樟脑磺酸)

    内标法 + 校正因子

    内标物——苯酚

脂溶性维生素  外标法

 

第四节   维生素D的分析

 

一、结构与性质

维生素D2为9,10-开环麦角甾-5,7,10(19),22-四烯-3β-醇,又名骨化醇(calcifyerol)或麦角骨化醇(ergocalciferol)。

维生素D3为9,10开环胆甾-5,7,10(19)-三烯-3β-醇,又名胆骨化醇(colecalciferol)。

 

二者差别仅是维生素D2比维生素D3在侧链是多一个双键,C24上多一个甲基。

 

5min

(教案续页)

基本内容

注解(进展、辅助

手段和时间分配)

线

 
(二)性质

1、性质  无色针状结晶或白色结晶性粉末;无臭,无味;遇光、空气易变质。

2、溶解性  易溶于有机溶剂,略溶于植物油,不溶于水。

3、不稳定性  含多个烯键,遇光、空气或其它氧化剂易氧化变质;对酸也不稳定。

4、旋光性  维生素D2具6个手性碳原子,维生素D3具5个手性碳原子,均具旋光性。

5、显色反应 

6、紫外吸收特性 浓度10μg/ml,256nm

   维生素D2   =460~490;

     维生素D3   =465~495。

二、鉴别试验

(一)显色反应

1、与醋酐-浓硫酸反应   Ch.P(2005)

【鉴别】  (1) 取本品约0.5mg ,加氯仿5ml 溶解后,加醋酐0.3ml 与硫酸0.1ml,

振摇,初显黄色,渐变红色,迅即变为紫色,最后成绿色。  

2、与三氯化锑反应 

3、其它显色反应  与三氯化铁-----橙黄色

  与二氯丙醇和乙酰氯试剂-------绿色

(二) 比旋度鉴别  Ch.P(2005)  性状项下:

维生素D2

比旋度  取本品,精密称定,加无水乙醇溶解并定量稀释制成每1ml 中含40mg的溶液,依法测定(附录Ⅵ E),比旋度为+102.5°至+107.5℃(应于容器开启后30分钟内取样,并在溶液配制后30分钟内测定)。

维生素D3 

比旋度  取本品,精密称定,加无水乙醇溶解并定量稀释制成每1ml 中含5mg 的溶液,依法测定(附录Ⅵ E),比旋度为+105至+112°(应于容器开启后30分钟内取样,并在溶液配制后30分钟内测定)。

(三) 其他鉴别方法

TLC、HPLC、衍生物熔点、UV、IR

  

5min

(教案续页)

基本内容

注解(进展、辅助

手段和时间分配)

(四)维生素D2、D3的区别反应

讨论:维生素C碘量法的测量相差关内容。

课间休息十分钟

三、杂质检查

(一)麦角甾醇检查

维生素D2 [Ch.P(2005)]

线

 
【检查】  麦角甾醇  取本品10mg,加90%乙醇2ml 溶解后,加洋地黄皂苷溶液(取洋地黄皂苷20mg,加90%乙醇2ml ,加热溶解制成)2ml ,混合,放置18小时,不得发生浑浊或沉淀。

维生素D3无检查项。

()前维生素D的光照产物

D族维生素都是甾醇衍生物,只是侧链不同。

维生素D2D3分别从5,7-二烯甾醇前体7-氢胆甾醇和麦角甾醇的光照而得。  

 

线

 

5min

(教案续页)

基本内容

注解(进展、辅助

手段和时间分配)

线

 
四、含量测定

USP(24):化学法、色谱法和微生物法

BP(2000):化学法、光谱法和色谱法

Ch.P(2005):RHPLC

(一)维生素D测定法

本法系用高效液相色谱法(附录Ⅴ D)测定维生素D(包括维生素D2和D3,下同)及其制剂、维生素AD制剂或鱼肝油中所含维生素D及前维生素D经折算成维生素D的总量,以单位表示,每单位相当于维生素D0.025μg。

Ch.P(2005):

维生素D2含量测定:

【含量测定】  精密称取本品25mg,置100ml 棕色量瓶中,加三甲基戊烷80ml,避免加热,用超声处理助溶1 分钟使完全溶解,加三甲基戊烷至刻度,摇匀;精密量取上述溶液与内标溶液各5ml ,置50ml棕色量瓶中,加正己烷至刻度,摇匀,作为供试品溶液。照维生素D测定法(附录 K 第一法)测定,即得。  

维生素D3含量测定 :

【含量测定】  精密称取本品25mg,置100ml 棕色量瓶中,加三甲基戊烷80ml,避免加热,用超声处理1分钟使完全溶解,加三甲基戊烷至刻度,摇匀,作为供试品溶液。照维生素D测定法(附录Ⅶ K 第一法)测定,即得。    

测定应在半暗室中及避免氧化的情况下进行。 

线

 

10min

(教案续页)

基本内容

注解(进展、辅助

手段和时间分配)

线

 
无维生素A醇及其他杂质干扰的供试品可用第一法测定,否则应按第二法处理后测定;如果按第二法处理后,前维生素D峰仍受杂质干扰,仅有维生素D峰可以分离时,则应按第三法测定。 

第一法   

对照品贮备溶液的制备  根据各制剂中所含维生素D的成分,精密称取相应的维生素D2或D3对照品25mg,置100ml棕色量瓶中,加异辛烷80ml,避免加热,用超声处理助溶1分钟使完全溶解,加异辛烷至刻度,摇匀,充氮密塞,避光,0℃以下保存。

测定维生素D2时,应另取维生素D3对照品25mg,同法制成维生素D3对照品贮备溶液,供系统适用性试验用。

内标溶液的制备  称取邻苯二甲酸二甲酯25mg,置25ml量瓶中,加正己烷至刻度,摇匀。  

色谱条件与系统适用性试验  用硅胶为填充剂,正己烷-正戊醇(997∶3)为流动相,检测波长为254nm。量取维生素D3对照品贮备溶液5ml,置具塞玻璃容器中,通氮后密塞,置90℃水浴中加热1小时,取出迅速冷却,加正己烷5ml, 摇匀,置1cm具塞石英吸收池中,在2支8W主波长分别为254nm和365nm的紫外光灯下, 将石英吸收池斜放成45°,并距灯管5~6cm,照射5分钟,使溶液中含有前维生素D3、反式维生素D3、维生素D3和速甾醇D3;取此溶液注入液相色谱仪,测定维生素D3的峰值,先后进样5次,相对标准偏差应不大于2.0%;前维生素D3(与维生素D3的比保留时间约为0.5)与反式维生素D3(与维生素D3的比保留时间约为 0.6)以及维生素D3与速甾醇D3(与维生素D3的比保留时间约为1.1)的峰分离度均应大于1.0。

校正因子测定  精密量取对照品贮备溶液和内标溶液各5ml,置50ml量瓶中,加正己烷至刻度,摇匀;取一定量注入液相色谱仪,计算维生素D的校正因子f1。

另精密量取对照品贮备溶液5ml置50ml量瓶中,加入2,6-二叔丁基对甲酚结晶1粒,通氮排除空气后,密塞,置90℃水浴中加热1.5小时,取出迅速冷却至室温,精密加内标溶液5ml,加正己烷至刻度,摇匀;取一定量注入液相色谱仪,计算前维生素D折算成维生素D的校正因子f2。

f2=(Asmr-f1msAr1)/Ar2ms

式中  As为内标的峰值;  

mr为加入对照品的量;     

f1为维生素D的校正因子;

ms为加入内标物质的量;  

Ar1为维生素D的峰值;

Ar2为前维生素D的峰值。

含量测定  取各该制剂项下制备的供试品溶液进行测定,按下列公式计算维生素D及前维生素D折算成维生素D的总量(mi)。  

(教案续页)

基本内容

注解(进展、辅助

手段和时间分配)

线

 
     mi=(f1·Ai1+f2Ai2)ms/As  

式中  Ai1为维生素D的峰值;  

Ai2为前维生素D的峰值;

ms为加入内标物质的量; 

As为内标的峰值。 

第二法  

精密称取供试品适量(相当于维生素D总量600单位以上,重量不超过2.0g),置皂化瓶中,加乙醇30ml、抗坏血酸0.2g与50%(g/g)氢氧化钾溶液3ml[若供试量为3g,则加50%(g/g)氢氧化钾溶液4ml],置水浴上加热回流30分钟,冷却后,自冷凝管顶端加水10ml冲洗冷凝管内壁,将皂化液移至分液漏斗中,皂化瓶用水60~100ml分数次洗涤,洗液并入分液漏斗中,用不含过氧化物的乙醚振摇提取3次,第一次60ml,以后每次40ml,合并乙醚液,用水洗涤数次,每次约100ml,洗涤时应缓缓旋动,避免乳化,直至水层遇酚酞指示液不再显红色,静置,分取乙醚提取液,加入干燥滤纸条少许振摇除去乙醚提取液中残留的水分,分液漏斗及滤纸条再用少量乙醚洗涤,洗液与提取液合并,置具塞圆底烧瓶中,在水浴上低温蒸发至约5ml,再用氮气流吹干,迅速精密加入甲醇3ml,密塞,超声处理助溶后,移入离心管中,离心,取上清液作为供试品溶液A。

净化用色谱柱系统分离收集维生素D  精密量取上述供试品溶液A 500μl,注入以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的液相色谱柱,以甲醇-乙腈-水(50∶50∶2) 为流动相进行分离,检测波长为254nm,从计录仪上观察色谱图,要求维生素D与前维生素D为叠峰,并能与维生素A及其他干扰含量测定的杂质分开;准确收集含有维生素D及前维生素D混合物的全部流出液,置具塞圆底烧瓶中,用氮气流迅速吹干,精密加入已知内标浓度的正己烷溶液适量(不少于2ml,并使每1ml中含维生素D为50~140单位,内标物质与维生素D的重量比约为4∶1),密塞,超声处理助溶,即为供试品溶液B。

取供试品溶液B,按第一法进行含量测定,进样量为100~200μl。 

第三法  

供试品溶液的制备  取各该制剂项下制备的供试品溶液A,按上述第二法净化用色谱柱系统分离维生素D项下的方法处理,至用氮气流迅速吹干后, 加入异辛烷2ml溶解,通氮排除空气后,密塞,置90℃水浴中,加热1.5小时后,立即通氮在2分钟内吹干,迅速精密加入正己烷2ml,溶解后,即为供试品溶液C。

对照品溶液的制备  精密量取对照品贮备溶液适量,加异辛烷定量稀释制成每1ml中约含维生素D 50单位,精密量取2ml置具塞圆底烧瓶中,照供试品溶液制备项下的方法,自通氮排除空气后起,依法操作,得对照品溶液。

含量测定  在上述第一法的色谱条件下,取对照品溶液与供试品溶液C,交替精密进样200μl,量取维生素D的峰值,按外标法计算含量。

(教案续页)

基本内容

注解(进展、辅助

手段和时间分配)

线

 
 

第五节 维生素E

 

 

 

 

 

 

            苯并-二氢吡喃醇

  

名  称       R1         R2    相对活性

α-生育酚      CH3     CH3    1.0 

β-生育酚   CH3  H 0.5

γ-生育酚 H   CH3    0.2

δ-生育酚       H H 0.1

 

生物效价

   右旋体 消旋体   =  1.4 10

天然品)   合成品)

dlα生育酚醋酸酯

(教案续页)

基本内容

注解(进展、辅助

手段和时间分配)

线

 
  一、结构与性质

苯环 + 二氢吡喃环 + 饱和烃链

1、易溶于有机溶剂,不溶于水

2、UV

3、酯键   易水解

 

 

 

 

 

二、鉴别

(一)硝酸反应

 

取本品约30mg,加无水乙醇10ml溶解后,加硝酸2ml,摇匀,在75℃加热15分钟,溶液应显橙红色。

(二)三氯化铁-联吡啶反应

 

5min

5min

(教案续页)

基本内容

注解(进展、辅助

手段和时间分配)

线

 
  

(三)UV

0.01%无水乙醇中

λmax = 284nm

λmin = 254nm

= 41.0~45.5

(四)TLC

薄层板  硅胶G

展开剂  环己烷 -乙醚(4  :1)

    显色剂  硫酸(105℃  5′)

    VitE    Rf  = 0.7

三、检查 游离生育酚 

(一)原理

利用游离生育酚的还原性,将硫酸铈还原成硫酸亚铈

 

 

5min

(教案续页)

基本内容

注解(进展、辅助

手段和时间分配)

线

 
    (二)试剂

硫酸铈滴定液(0.01mol/L)

二苯胺(亮黄→灰紫)

   (M生育酚= 430.8)

例:取本品0.10g,加无水乙醇5ml溶解后,加二苯胺试液1滴,用硫酸铈液(0.01mol/L)滴定,消耗硫酸铈液(0.01mol/L)不得过 1.0ml

(三)限量  ≤2.15

          

药典规定

消耗硫酸铈液(0.01mol/L)≤1.0ml

若硫酸铈液浓度不是0.01000mol/L

应重新计算硫酸铈的消耗量

设:应消耗硫酸铈液≤ V ml

0.01×1.0 =实际浓度× V

例 Ce(SO4)2 = 0.01020mol/L

(四)含量测定

(一)GC

1、GC特点

选择性好 灵敏度高 速度快 分离效能好

挥发性低、不稳定、极性强→衍生化易受样品蒸气压限制

 

10min

哪些物质可采用GC法。

(教案续页)

基本内容

注解(进展、辅助

手段和时间分配)

线

 
   2、VitE测定的色谱条件

载气→N2

固定液→硅酮(OV-17)

担体→硅藻土或高分子多孔小球

柱温→265℃

检测器→氢火焰离子化检测   器(FID)

内标→正三十二烷

   n ≥ 500

   R≥2

 

 

 

 

 

 

内标法

供试液(样品+内标)

对照液(对照+内标)

 

是样品中不存在的物质

与被测组分峰靠近

内标物   能与各组分完全分离

与被测组分的量接近

 

校正因子

 

 

 

 

 

 

 

(教案续页)

基本内容

注解(进展、辅助

手段和时间分配)

线

 
  实际工作中的计算方法

    

例:内标液  取正三十二烷加正己烷溶解并稀释成1.0mg/ml溶液.

对照液  精密称取VitE对照品0.2011g置棕色具塞锥形瓶中,精密加入内标液10ml,密塞,振摇使溶解,取1~3ul注入GC仪,测定,计算.

供试液  精密称取供试品0.1998g置棕色具塞锥形瓶中,精密加入内标液10ml,密塞,振摇使溶解,取1~3ul注入GC仪,测定,计算。

对照液  

 

供试液

本品含C31H52O3应为96.0 ~ 102.0%  

BP GC 

内标 正三十二烷

R≥1.4

USP GC 

  内标 十六酸十六醇酯

  R≥1.0

JP   HPLC 

  外标  dl-α-生育酚

R≥1.4   

什么是内参照峰?其要求是什么?

(教案续页)

基本内容

注解(进展、辅助

手段和时间分配)

线

 
  (二)铈量法

1、原理  利用生育酚的易氧化性

 

 

 

 

2、指示剂

  二苯胺(亮黄  →  灰紫)

   还原型  氧化型

3、讨论

A、反应速度

分子量较大,

反应慢易被O2氧化     25滴/10s

B、溶剂

Ce(SO4)2易溶于水

生育酚易溶于醇       乙醇+水

C、酸性条件

防止Ce(SO4)2的水解

减慢生育酚被O2氧化速度   H2SO4

4、含量计算

MVitE  =  472

(三)JP - RP - HPLC法(外标法)

样品→ dl-α-生育酚

固定相→十八烷基硅烷键合硅胶

流动相→甲醇-水(49  :1)

检测波长→292nm

   R>2.6

   RSD≤0.8%  

    

计算过程板书分步演示。

(教案续页)

基本内容

注解(进展、辅助

手段和时间分配)

线

 
  (四)RP - HPLC法(外标法)

测定对象→血清中VitAVitE

固定相→十八烷基硅烷键合硅胶

流动相→甲醇-水(96  :4)

检测波长→  8′前330nm

8′后292nm

      

  

  

问题讨论(5min)

作业和习题布置(2min)

归纳总结(3min)

(教案末页)

小 结

本次课主要讲授了①维生素C的含量测定方法,主要为碘量法(掌握);②维生素D含量测定的第一法;③维生素E的结构、性质及检查。

线

 
 

复习思考题

作 业 题

1、维生素C碘量法含量测定中需注意的事项。

2、维生素D2、D3的区别反应。

3、维生素E的鉴别试验。

4、维生素D要进行哪几项特殊杂质的检查?

教 学 效 果

与 分 析

多媒体教学和板书相结合,并结合一定的实例,加深学生对知识点的认识和了解。特别是通过问题讨论,让大家对所学知识进行回顾、讨论,建立一个互动的教学氛围。效果较好。

...
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