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药学的生物化学-学术讲座:现代生物技术与生物药物

药学的生物化学:学术讲座 现代生物技术与生物药物:现代生物技术与生物药物中国药科大学 姚文兵内 容 摘 要21世纪,人类将迎来生物经济的时代,生命科学的飞速发展,已使以化学为主体的传统药学研究模式迅速向以生命科学与化学相结合的新型模式转变发分子生物学为代表的现代生物技术的研究与完成虽然只有短短几十年的时间,却对药学学科从新药发现、药物研究、药物生产、药物质量控制好药品,临床应用等方面均产生了重要的影响,同时,以现代生物技术手段生产的干扰素、白细胞

现代生物技术与生物药物

中国药科大学  姚文兵

内 容 摘 要

21世纪,人类将迎来生物经济的时代,生命科学的飞速发展,已使以化学为主体的传统药学研究模式迅速向以生命科学与化学相结合的新型模式转变发分子生物学为代表的现代生物技术的研究与完成虽然只有短短几十年的时间,却对药学学科从新药发现、药物研究、药物生产、药物质量控制好药品,临床应用等方面均产生了重要的影响,同时,以现代生物技术手段生产的干扰素、白细胞介素、红细胞生成素为代表的数十种生物技术药物在临床的成功应用,使医药生物技术成为生物技术领域发展最快,效益最高,最具发展前景的一个应用领域;全球生物工程和新医药产业,伴随着生命科学的突飞猛进,始终保持着良好的发展势头,并在全球经济中占有越来越重要的位置。因此,及时反映生物技术的原理、技术、方法在制药领域的应用,顺应国际生物医药产业的发展趋势,使药学及相关专业,包括执业药师等能及时了解生物技术制药的最新发展动态是十分必要的。

第一章  现代生物技术的内涵

一、生物技术的定义

以电子信息技术、新药源技术、航天技术、生物技术、新材料技术等为代表的高技术是20世纪人类科学技术事业最伟大的成就。生物技术,英文为Biotechnology,有时也被人们称为生物工程(Bioengineering),这可能强调这一领域源发于生命科学与工程技术的结合。但是由于在国际上应用Biotechnology这一术语远较Bionengineering普遍,所以在我国生物技术这个名称似乎更为通用。

那么什么是生物技术,究竟如何定度它,在这一点上,国内外的学者曾下过多种大同小异的定义,综合这些定义,我们可以这样来理解它:

“生物技术就是利用生物有机体(这些生物有机体包括从微生物至高等动、植物)或其组成部分(包括器官、组织、细胞或细胞器等)发展新产品或新工艺的一种技术体系。”

一般认为,生物技术包括四个方面:

(1)基因工程:主要涉及一切生物类型所共有的遗传物质——核酸的分离、提取、体外剪切、拼接重组以及扩增与表达等技术。

(2)细胞工程:包括一切生物类型的基本单位——细胞(有时也包括器官或组织)的离体培养、繁殖、再生、融合发及细胞核、细胞质及至染色体与细胞器(如线粒体、叶绿体等)的移值与改建等操作技术。

(3)酶工程:指的是利用生物机体内酶所具有的特异催化功能,借助固定化技术,生物反应器和生物传染器等新技术、新装置、高效优质地生产特定产品的一种技术。

(4)发酵工程:也有人称为微生物工程,就是给微生物提供最适宜的发酵条件生产特定产品的一种技术。

生物技术的这四大组成部分虽然均可以自成体系,构成独立的完整技术,但在许多情况下又是高度相互渗透和密切相关的,事实上如果没有这种相互渗透和彼此依赖生物技术也就不可能成为高新技术,因为生物技术的依据和出发点是生物有机体本身的种种机能,是各类生物在生长、发育与繁殖过程中进行物质合成、降解和转化的能力(也就是利用其新陈代谢的能力),各种生物,不管是低等的细菌、真菌等微生物,还是高等的动物、植物、人,其新陈代谢的过程就好像是一座反应器,而且是效率极高的反应器,在此反应器中,各种各样代谢反应(化学反应)在各种生物催化剂——酶的催化下有条不紊地进行,而什么酶催化什么反应,该酶具有什么样的特异结构与功能,又是受特定的遗传基因所决定,所以从某种意义上说,基因工程和细胞工程可看做是生物技术的核心基础,因为通过基因工程和细胞工程可以创造出许许多多具有特殊功能或多种功能的“工程菌株”或“工程细胞株”,这些“工程菌株”或“工程细胞株”往往可发使酶工程或发酵工程生产出更多、更好的产品,发挥出更大的经济效益,而酶工程和发酵工程往往又是生物技术产业化,特别是发展大规模生产的最关键环节,因此,生物技术所包括的四个方面应当是一个完整的整体。

2.20世纪生物学的成就回顾

生物学在20世纪取得了巨大进展。数理科学广泛而广泛而又深刻地渗入生物学的结果,全面改变了生物学的面貌,开辟了在分子水平研究生命现象的新学科——分子生物学。分子生物学的研究,涉及生命现象最本质的内容,它把在各层次的生命活动有机地联系起来,在新的高度上揭示生命的奥秘,从而全面地改变了生物学的面貌,推动了生物学的发展,并成为现代生命科学的“共同语言”。细胞生物学、神经生物学和结构生物学研究,均己进入了分子水平,成为生物学领域内新的主要生长点。生物分类学和生物进化的研究也因分享了分子生物学的最新研究成果而焕发了青春。

分子生物学把生命现象中的物质形态还原为分子,把分子进一步还原为亚分子、结构域(domain)、结构域单元(motif)和原子团;把功能还原为“结构”,把现象还原为调控;把“效应”与“信号转导”相联系等等。分子生物学的还原认识论促进了现代生物科学的发展,提高了人们对生命现象和过程的整体综合认识水平,成为当代生命科学基础研究的发展,提高了人们对生命现象和过程的整体综合认识水平,成为当代生命科学基础研究的前提,开辟了现代生物学的全新局面。在实际应用中,它又使生物学以空前主动的态势对人类的物质生产品和社会生活产生重大影响。1973年重组DNA获得成功,诞生了基因工程学,以此为基础,生物高新技术及其产品的生产正在成为前途远大的高技术产业,动物克隆技术生物学信息产业的兴起,更是举世瞩目。生物工程必将在21世纪成为现代化的大工业,并极大的推动医药学和农业科学的发展,在这些领域中现代生物学的发展正在展示出的广阔应用前景,必将又一次引起人类社会和经济生活的革命。

3.现代生物化学的重要发展领域

(1)结构分子生物学

当今生命科学研究的特征是对分子、细胞、组织、器官及至整体水平的多方位综合研究。生命活动是核酸、蛋白质等大分子的运动形式,以研究生物大分子的结构、功能为对象的结构分子生物学已成为生命科学的基础学科之一。结构分子生物学是研究各种生物大分子的结构从简单结构(一级结构)到复杂结构(空间结构及分子相互作用结构),都是体现生物信息的“语言”,把这些结构信息“语言”转换成计算机语言,人们就可应用计算机来贮存生物信息,分辨生物信息,提取生物信息,并对任何感兴趣的生物大分子的结构、功能及结构与功能的关系进行分析、预测和比较研究。由此生长点出发,诞生了“生物信息学”(bioinfomatics)或计算机生物学(computational biology),由于研究生物大分子结构的新技术、新方法和新仪器不断改进和涌现,如DNA重组技术、基因合成和测序技术、X-射线衍射分析技术、核磁共振技术、酶逐步降解技术、计算机技术以及不同技术的组合应用等,使获得高分辨率的结构图像,了解生命过程中蛋白质构象的动态变化以及对大分子结构的贮存、比较和结构一功能预测成为可能。现在,生物大分子的三维结构的数据库迅速扩大,以蛋白质结构数据库为例,每天都有几个新的结构增加进来。已阐明了许多具有重要生物学意义和难度较高的生物大分子的结构,如胰岛素天花粉蛋白、人的组织相容性抗原、生长激素与受体复合物、人和动物的一些致病病毒颗粒、HIV蛋白蛋白酶、CD4糖蛋白、细胞器、细胞膜复合物、核糖体等。这些结果表明,已有的技术手段,不仅能搞清楚单纯的生物大分子的三维结构,从而把微观形态与解剖形态联系起来,把大分子与细胞和亚细胞结构联系起来;进而对生物大分子在生命活动过程中的空间结构的连续变化进行动态观察和分析研究,如已能在毫秒级水平测定酶-底物作用时的构象变化,蛋白质变性和新生肽折叠时的构象变化以及分子伴娘识别多肽和帮助多肽折叠时的构象变化。

结构分子生物学的研究对于研究发病机制与设计诊断、治疗和预防方案具有重要意度,特别对新药的分子设计与模拟,具有重要指导作用,它已成为合理药物设计(rationa drug design)的理论基础。

(2)基因组学

“人类基因组计划”(human genome project, HGP),于1990年正式出台,其主要目标是绘制遗传连锁图、物理图、序列图和转录图。经过国际合作,上述目标原来预计在2003年前完成。现已完成遗传连锁图和物理图,人类基因组工作草图也已在2000年6月23日宣布绘制完毕,标示着对人类遗传密码“基因组”全部碱基对的解读已基本告一段落,昭示了人类对自身的了解进入了一个新阶段。另外,还完成了细菌、古细菌、支原体和酵母等共17种低等生物的全基因组的序列测定,并逐步扩展到各种模式生物基因组、经济运动和作物基因组等的研究,这些将是21世纪生命科学领域中的研究热点。“基因组学”(genomics)主要是解决人类基因组的“结构”,在这一目标越来越趋过完成时,人们又提出“后基因组学”(postgenomics),其实质是将人类基因组研究的重心逐步由“结构”向“功能”转移。即有关基因组功能信息的摄取、鉴定和开发利用,以及与相关的数据资料、基因材料和技术手段的贮存和使用。所以“后基因组学”的主要研究内容包括人类基因的识别和鉴定以及基因功能信息的提取和鉴定;在过去几年里,国际上一批知名的大型制药集团和化学公司已在基因组研究领域投入巨资,并形成了一个新的产业部门,即生命科学工业。制药工业就是生命科学工业的主要支柱,与基因组研究尤其关系密切。药物基因组学(pharmacogenomics)研究表明,药物的疗效与患者的基因型相关。因此,今后的药物生产须考虑药物投放地区人群中有关的等位基因的频率,医疗处方也将因人而异,并趋向个性化。比较基因组学的研究,则有助于从模式生物的资料找到与疾病可能相关的基因,并以此为靶来设计药物,这就表明现代生物化学发展的另一个重要特点是基础研究与应用研究的密切结合。医药学和农学的发展不断地向生物化学和分子生物学提取挑战,随着基因工程、蛋白质工程、细胞工程和胚胎组织工程的发展,人类在战胜各种传染病、冠心病、艾滋病、肿瘤、计划生育和抗衰老等方面一定会取得更为有效的手段。当前生物化学的基础研究成果到实现产业化的时间距离已大大缩短,如某些细胞因子从基因的发现到生物工程产品的开发,只需要1~2年时间,这就有力地证明生物化学基础研究与现代药学科学的发展具有密切关系和巨大应用潜力。

(3)蛋白质组学

研究代谢反应与生理机能的关系是机能生物化学的核心内容,对蛋白质的研究现已从翻译加工过程的作用机制这一极转向研究蛋白质降解机制的另一极。在“后基因组”时代出现的一个新领域就是蛋白质组学(proteomics)。蛋白质组学是研究细胞内全部蛋白质的组成及其活动规律的新兴学科。由于mRNA储存和翻译调控后加工等的存在,并不能直接反应蛋白质的表达水平;蛋白质自身特有的活动规律,如蛋白质的修饰加工、转运定位、结构形成、代谢转化、蛋白质与蛋白质及其他生物大分子的相互作用等,均无法从基因组水平上的研究获知,因此,对生物功能的主要体现者或执行者——蛋白质的表达模式和功能模式的研究就成为生物化学发展的必然。

蛋白质组是指基因组表达的所有相应的蛋白质,也可以说是指细胞或组织或机体全部蛋白质的存在及其活动方式。蛋白质组学是从整体的蛋白质水平上,在一个更加深入、更加贴近生命本质的层次上去探讨和发现生命活动的规律和重要生理、病理现象的本质等,蛋白质组具有多样性和可变性。蛋白质的种类和数量及其功能状态在同一机体的不同细胞中是各不相同的,即使是同一种细胞,它在不同时期、在不同条件下,其蛋白质组也是在不断的改变之中。此外,在病理状态下或治疗过程中,细胞蛋白质的组成及其变化,与正常生理过程的也不同。随着蛋白质组学的诞生,人类就有可能从生物大分子整体活动的角度来认识生命,进而在分子水平上,从动态的整体的角度对生命现象的本质及其活动规律和重大疾病的机制进行研究。蛋白质组学的研究内容是蛋白质的表达模式与蛋白质的功能模式。

蛋白质的表达模式主要解决各种细胞或组织的所有蛋白质的表征问题。目前是通过二维凝胶电泳(2DGE)建立一种细胞或组织的蛋白质组二维图谱,通过计算机模式识别分析各蛋白质的等电点和分子量参数及蛋白质点强度、面积等。再结合以质谱分析为主要手段的蛋白质鉴定及数据库检索,从而大量鉴定其蛋白质组成员,形成相应的蛋白质组数据库。建立机体或组织或细胞的正常生理条件下的数据库是进行大规模蛋白质组分析研究的基础。蛋白质组分析的第二步是比较分析在不同条件下蛋白质组的变化,如蛋白质表达量的变化、翻译后的加工修饰等;或进一步分析蛋白质在亚细胞水平上的定位的改变等,从而发现和鉴定出特定功能的蛋白质(群)。

蛋白质组功能模式的研究主要是揭示蛋白质相互作用的连锁关系和蛋白质发挥功能所依赖的结构基础,并为了解大量涌现出的新基因的功能提供依据。蛋白质组学不断的深入发展,将在揭示诸如生长、发育和代谢调控等方面取得突破,并为探讨发病机制、疾病诊断与防治和新药开发提供重要的理论基础。例如可以应用蛋白质组技术发现药物作用的新靶点和研究药物代谢酶谱的变化以及药物产生毒副作用的相关蛋白质因子,从而为发现新药、研究药物作用机制以及指导临床合理用药提供可靠的理论依据。

  (4)神经生物化学

神经生物化学可能是现代生化发展的最大热门,因为神经系统不仅是生命活动的中枢,而且与学习、记忆、语言等生命活动直接相关,可能是生命活动中最复杂、最精细的内容。人脑是神经系统最高的组织形式,是最复杂的器官,是一切精神活动的物质基础。分子生物学的概念与技术已渗透到神经生物学的多个分支,并与其他实验技术相结合,推动神经生物学的全面发展,近10年来,神经生化的研究已取得了惊人的进展。

a.突触传递和膜兴奋分子元件的结构和功能  根据结构,受体可分为三类,包括递质(配体)门控性分子通道、G蛋白偶合受体和催化性受体,这三类受体的结构都已通过重组DNA技术克隆阐明,受体的克隆为寻找新的高选择性的药物提供了机会。大量的细胞外信号需要通过G蛋白转导为细胞内效应,已知G蛋白可以直接影响离子通道。根据 G蛋白的。亚基结构,G蛋白可分为Gs、Gi、Go、Gq、G?和Gt六类。递质转运蛋白又使释放的神经递质回到末梢或摄取到胶质细胞,许多递质转运蛋白也被克隆,如GABA转运蛋白和囊泡膜的单胺类转运蛋白等。与递质释放的某些有关分子,已有多种获得纯化,如Synapsins,VAMP(Synaptobrevin)、Synaptopyhsin, Synaptotagmin, RAB-3、Syntaxin等以及囊泡递质转运蛋白。电压门控性离子通道研究较多的有钠通道、钙通道和钾通道,而首先被克隆的是钠通道。

b.神经系统发育研究已发现,决定成为神经元的基因有Proneural基因(赋与细胞有发育成神经元的潜能),Neurogeni基因(选择成神经元)和Selector基因(决定成为那一种类型的神经元)。一旦细胞被决定发育成为神经之后,需要一些物质使它分化为成熟并继续存在,这种物质称为神经营养因子,如神经生长因子(NGF)。神经元之间建立联系要依赖许多分子暗号(molecular cues),神经元轴突的生长锥(growth cone)有识别分子暗号的受体,在不同时间和空间先后表达,以建立神经之间相互联系的分子机制。

c.重组DNA和神经系统疾病 应用基因治疗技术在帕金森症方面已取得进展,神经营养物质,如NGF已能用重组DNA技术生产,多种神经系统遗传性疾病和退化性疾病的基因已被克隆,它们的基因治疗已被提上日程。

二、生物技术的优越性

生物技术自问世以来就向世人展示它可以多方面应用并可发展成相应的产业,因而  很快受到农业界、医药卫生界、化学与食品工业界以及环境保护界等各行各业的极大兴  趣和高度重视,原因是生物技术具有以下的优越性。

 (一)不可取代性

生物技术能完成一般常规技术所不能完成的任务,能生产出其他方法所无法生产或  难以生产的产品。

例如:某种植物的品种改良一般采用的是杂交育种,目的在于提高产量,增加抵抗力等,但是常规的杂交育种一般只限于物种内部,如小麦与小麦,最多只能扩展到亲缘关系较近的种属,因为常规改良育种,能重组到良种基因中的遗传资源是受到限制的,但是,用基因工程改良品种,基因资源的来源就可能不受这种限制,如将细菌中的一种毒素转人烟草马铃薯中,则这种烟草和马铃薯就不会受害虫的危害。又如西红柿去掉腐烂基因,常温几周不坏,把牛或猪的生长激素基因转移给鱼,使鱼的生长、发育加快,体重迅速增长,把人的血红蛋白的基因转移到猪体内,则使猪可以生产人的血红蛋白,分离这种血红蛋白可以作为人血液的替代物等等。而在医药行业,这样的例子就更多,很多人体内的生长代谢必需的物质由于其含量极微,是很难通过分离、提取或合成的方式生产的,如:生长激素释放抑制因子,这是一种人脑激素,它的正常作用是抑制生长激素不合时宜的分泌,所以是一种很有用的药物,有一种病叫做“肢端肥大症”患者脸形增大、面貌粗陋、手足厚大、生长激素释放抑制因子就是治疗肢端肥大症的特效药。可是要得到生长激素释放抑制因子相当不容易,人类第一次分离得到它是1793年,经过了21次的努力,用了50万个羊脑,得到了5mg样品,后来也用化学法合成,但5mg价格仍在300多美元。基因工程方法成功以后, 7.5升大肠杆菌发酵就可得5mg,成本仅几十美分,类似这样的例子十分多。

(二)快速、精确

用生物技术生产的试剂盒可以快速、精确地对人类和动、植物疾病进行有效的早期诊断,这对疾病的预防和及时治疗十分重要(尤其是遗传病、病毒引起的疾病和癌症等严重影响人类健康的疾病),例如用单克隆抗体检查妇女妊娠比用抗血清法检查进一步提高了灵敏度,使妇女能在怀孕后8天即得知,准确率可达100%,无疑这一方面对计划生育是非常有用的,这种妊娠检查可以避免在不知妊娠情况下服用对胎儿有害的许多药物,从而保证了胎儿的早期健康发育,对实现优生优育也具有特别重要意义。

(三)低耗、高效

用生物技术对化学工业和制药工业进行技术改造具有能耗低,效率高和不依赖特定原料等优点,例如用生物催化剂“酶”催化化学效应,不像用化学催化剂那样需要高温、高压和强酸碱等苛刻的条件,这样就大大降低了能耗的成本,通过生物技术降低成本和能耗的例子,在有机酸和氨基酸的生产中已很明显:

例如L-苹果酸生产(生物技术)

这样生产的L-苹果酸其成本要比化学合成降低几十倍。

又如:治疗侏儒病的人生长激素,过去只能从死人的脑垂体提取,一个侏儒患者每年所需的用药量大约要从50个死人的脑垂体中提取,价格十分昂贵且来源十分困难,而用基因工程生产人生长激素价格只有提取的1/4,更为关键的是不需要依赖死人脑这样紧缺的原料来源。

(四)副产物少、副作用小、安全性好

众所周知,制药行业(特别是化学合成药)也是一种高污染产业,废气、废水和一些副产物有时都有毒性,又如疫苗的生产,常规方法就是用血液,这不仅成本高,同时也有可能带来病毒感染的危险性。事实上,在国内外已出现了很多这方面感染的例子,而通过生物技术,用大肠杆菌来生产这些药物,如乙肝疫苗,凝血因子等,就大大改进了使用这些药物时的安全性。

由于生物技术新产品、新工艺的上述优越性,许多国家特别是发达国家都竟相开展生物技术的研究和发展生物技术产业,特别是一些著名的跨国公司,如美国的杜邦、孟山都;英国的帝国化学公司;日本的三井、三菱、住友、武田制药、味之素;德国拜耳;荷兰的壳牌化学公司;瑞士的西巴-嘉基等。目前国际上能够排得上名次的生物技术公司已达数千家,我国1987年初开始实驰的“高新技术研究发展计划纲要”(863计划)中,生物技术被列为7领域的重点之一。但是也有几点需要明确的是,生物技术也像其他高技术一样是一种知识密集形和资金密集型技术,需要高强度,一次性财力人力和物力投入,这对我国的许多企业来说还是有较大因难的,必须引起步够的重视。

三、生物技术在医药领域的应用

(一)基因工程药品

在后面的章节将对基因工程药品有专门叙述。

(二)生物技术在疾病诊断与治疗中的应用

1.单克隆抗体与疾病诊断。妊娠试验所经历的变革足以说明单克隆抗体的应用对医学产生的巨大影响。类似这样能有效提高诊断水平的单克隆抗体已得到迅速发展。美国食品与药物管理局批准上市的单克隆抗体产品已有几十种。

2.“生物导弹”。用药物治疗肿瘤的难题在于使用的药物在杀伤肿瘤细胞的同时也杀伤正常分裂的细胞,毒副作用严重。于是人们设想,如能制备抗某种肿瘤的单克隆抗体,再在其上接上抗癌药物,进入体内,让该单克隆抗体只与该肿瘤细胞特异性结合,岂不就能像导弹那样把抗癌药物专一地、靶向地带到肿瘤细胞而不影响其他细胞?这就是“生物导弹”。但是,按现行制备单克隆抗体的技术路线,所得单克隆抗体是小鼠的免疫球蛋白,对人体来说是异种蛋白,进入人体后易遭排斥而不能有效地到达“靶点”。国外有人用蛋白质工程构建杂合抗体,使作为“生物导弹”的单克隆抗体免疫球蛋白分子中含有人免疫球蛋白分子片段,明显地提高了效果。

3.基因诊断。基因诊断是1978年由简悦威等在镰状细胞贫血症的研究中突破的。他们采用的是核酸分子杂交的方法。运用同样的方法,已经有一大批重要的遗传病,如苯丙酮尿症、珠蛋白合成障碍性贫血、假肥大型肌营养不良、甲型血友病、乙型血友病、成年型多囊肾慢性进行性舞蹈病等,建立了产前基因诊断和症状前基因诊断的方法。将核酸分子杂交技术应用于传染病病原体的检测,方法更为简单。80年代中期以来,基因诊断技术又广泛应用了聚合酶链反应体外扩增基因的方法。就生物技术而言,聚合酶链反应已成为最有用的技术之一。

4.基因治疗。基因治疗的最初目标是一些因单一结构基因即编码蛋白质的基因缺陷所引起的遗传病,因此,其治疗方式就是通过导入正常基因来校正缺陷基引起的DNA代谢异常以及细胞突变,从而使之恢复正常功能。世界上第一位受益于结构基因药物治疗的是一位叫Ashanti的美国女孩。1990年9月14日,4岁Ashanti成为美国政府批准的基因治疗第一人。

(三)未来医药卫生领域中的生物技术展望

1.转基因动物生产的“转基因药物”。用转基因动物生产人用医药制品是基因工程制药业中新崛起的最富有诱人前景的行业。1978年科学家们把人tPA基因转入小鼠受精卵发育成转基因小鼠并证明在其乳汁中能得到tPA以来,美国和英国已组建4家生物技术公司专门从事用转基因动物生产“转基因药物”,并各具特色,如美国DNX公司的“制药工厂”用转基因猪,环球基因药物公司用转基因奶牛,基因酶公司用转基因山羊,英国药物蛋白公司则用转基因绵羊。用转基因动物生产“转基因药物”与用细菌、酵母菌或动物细胞生产基因工程药物相比较,最大的优点是产量高,另一大优点是成本低,再者转基因产品具有与人体自身产生的蛋白相同的生物学活性。这些动物的乳腺细胞能进行一系列的翻译后修饰作用,包括糖基化和γ羧化作用等,正确地产生人体蛋白。

2.人型单克隆抗体的制备。有几条可供采用的技术路线。一是在鼠型单克隆抗体分子中用蛋白质工程的方法更换一段人抗体分子中与抗原结合的链段。二是从人鼠杂交瘤细胞中直接克隆人抗体基因并使之在细菌中得到表达。三是将人免疫球蛋白重链C区基因转入小鼠受精卵,发育成转基因小鼠,用特定抗原免疫这种转基因小鼠,就直接得到人型化的单克隆抗体。

3.基因治疗。通过各种手段导入的外源基因在细胞中的整合位点一般是随机的,这很可能影响基因治疗的效果,甚至导致与预期目标相反的结果,80年代末兴起的“基因打靶”技术能将外源基因定点整合到细胞基因组的某一确定位点上,因而能对缺陷基因进行原位修复,在今后,“基因打靶”的效率将会得到大幅度提高,使基因治疗的临床应用建立在安全可靠的基础上。

4.生物技术的各个环节。各个环节将不断得到改进。首先是聚合酶链反应及其他不断涌现的分子生物学新技术将得到广泛应用。同时,在细菌、酵母菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞等不同的细胞内能得到高效表达的载体将不断地构建成功,大幅提高基因工程的生产效率。此外,生物技术后处理工程和蛋白质工程将迅速发展,通过蛋白质工程修饰和改造基因工程产品以及有目的地修饰、改造乃至重新组建蛋白质分子结构的理想将逐步实现。

三、生物技术与化学、食品工业

(四)利用生物技术开辟新的食品资源

1.单细胞蛋白――食品与饲料的新来源

蛋白质是为此生命的基本物质,全世界蛋白质缺乏的问题已存在多年,开发单细胞蛋白,正是用生物技术解决这一问题的一条重要途径。单细胞蛋白就是从酵母或细菌等微生物菌体中获取得蛋白质,单细胞蛋白的氨基酸组成不亚于动物蛋白质,如酵母菌体蛋白,其营养十分丰富,人体必需的8种氨基酸,除蛋氨酸外,它具备7种。微生物细胞中除含有蛋白质外,还含有丰富的碳水化合物以及脂类、维生素、矿物质,因此单细胞蛋白营养价值很高。生产单细胞蛋白质的原料来源极为广泛,一般有四类,一是糖质原料,二是石油原料,三是石油化工产品,四是氢气和碳酸气,最有前途的原料是可再生的植物资源,如农林加工产品的下脚料、食品工厂的废水下脚料等。许多国家单细胞蛋白的生产已具有很大的规模,取得了丰硕的成果。单细胞蛋白在饲料和食品工业中有着极重要的作用。单细胞蛋白作为饲料蛋白,已被世界广泛采用。例如用假丝酵母及产盶酵母作为菌种,利用亚硫酸废液或石油生产酵母菌体,可用于牲畜饲料,以酵母菌和假丝酵母菌生产的单细胞蛋白,可直接用作人的食品。单细胞蛋白在食品加工中也有着重要作用,它能提高食品的物理性能、风味等。

1. 制糖工业的巨大变革――淀粉糖的生产

传统制糖工业主要以甘蔗、甜菜为原料生产蔗糖,糖原不足、价格昂贵与产品甜度不高是制糖工业面临的大难题。生物技术在这里发挥了巨大的作用,首先,食品科学家将糖源目标转移向来源充足、价格低廉的淀粉,其次,为了提高产品的甜度,食品科学家使用葡萄糖异构体酶成功地将葡萄糖转化为甜度远高于蔗糖的果糖,产品称为高果糖浆。近年来,采用酶工程还成功地将淀粉加工成为饴糖麦芽糖、高麦芽糖浆、麦芽糊精、偶联糖等各类淀粉糖产品,它们在食品工业中均起重要作用。淀粉糖的生产作为制糖工业的一大变革,其经济效益十分显著。目前这种新型低价糖正逐步替代蔗糖,广泛应用于各类食品和饮料。

(五)利用生物技术提高食品品质

1.食品添加剂。①酸味剂。发酵工程在酸味剂的生产中显示了巨大的作用,例如发酵法制得的L-苹果酸是国际食品界公认的安全性食品添加剂,是加工果、果汁、饮料、合成酒、罐头、糖果、人造奶油等地优选酸味剂之一。②甜味剂。天冬氨素是一种低热甜味剂,其甜度高达蔗糖的200倍,世界各国已大量生产利用,过去是采用化学方法合成,又两个缺点,一是产生有苦味的β-型体,必须纯化除去,二是工艺较为复杂,生产成本偏高,改用酶法合成新工艺,可降低成本,提高产量。③鲜味剂。味精又称L-谷氨酸钠,具有强烈的肉类鲜味,过去主要用天然蛋白质水解制得,而今普遍采用糖质原料进行发酵法生产。鸟苷酸和肌苷酸为新型鲜味剂,它们与味精混合使用能成倍地提高鲜味,这些呈味核苷酸与味精混合作为复合调味料,国际市场上称作强力味精,是极有发展前途的调味品,在食品工业总具有很重要的地位。发酵工程在这两种新型鲜味剂的生产中也发挥了巨大的作用,例如采用产氮短杆菌突变株进行直接发酵生产,肌苷酸产量可达20g/升,鸟苷酸3g/升。

2.用于食品加工中的酶。①肉类和鱼类加工。酶在肉类和鱼类加工中的主要作用在于:改善组织,嫩化肉类;转化废弃蛋白;鱼类解冻脱腥等。②蛋品加工。采用生物技术新成果——用葡萄糖氧化酶处理禽蛋白中的微量葡萄糖,使氧化成葡萄糖酸,可有效阻止葡萄糖的醛基与蛋白质、氨基酸等的氨基发生羧氨反应导致的蛋白的褐变,该法效率高,周期短,并可改善环境卫生。③乳品工业。酶工程在乳品工业中发挥了重要作用,如用发酵法生产凝乳酶,进而用于干的生产;分解牛奶中的乳糖;黄油的增香;奶粉中添加卵清溶菌酶预防婴儿肠道感染等。④果蔬加工。酶在果蔬加工中的主要作用有水果罐头加工,如利用黑曲霉除制作橘子罐头中需要除去的橘瓣囊衣;橘类脱苦,利用球形节杆菌固定化细胞的柠碱酶处理橘子中的柠檬苦素;果汁加工,利用果胶酶处理溃碎果实,加速果汁过滤,促进澄清;水果蔬菜保藏,用葡萄糖氧化酶出去脱水蔬菜中的糖分,可防止储藏过程中发生褐变。⑤饮料、酿酒工业,白酒生产中采用糖化酶代替麸曲可提高出酒率,节约粮食,简化设备,节省厂房场地。⑥焙烤食品。用酶活力高的面粉制成的面包,气孔细而分布均匀,体积大,弹性好,色泽佳。

此外,生物技术在食品卫生检验、食品脱毒等方面均有崭新的贡献。

第二章  生物药物

一、生物药物的概念

化学药物、生物药物与中草药是人类防病、治病的三大药源。生物药物(Biopharmaceutics)是利用生物体、生物组织或其成分,综合应用生物学、生物化学、微生物学、免疫学、物理化学和药学等的原理与方法制造的一大类用于预防、诊断、治疗的制品。广义的生物药物包括从动物、植物、微生物等生物体中制取的各种天然生物活性物质及其人工合成或半合成的天然物质类似物。随着基因重组药物、基因药物和单克隆抗体的快速发展,生物药物已获得极大的扩充,现代生物药物已形成四大类型:①基因重组多肽、蛋白质类治疗剂,即应用重组DNA技术(包括基因工程技术、蛋白质工程技术)制造的重组多肽、蛋白质类药物;②基因药物,即基因治疗剂、基因疫苗、反义药物和核酶等;③天然生物药物,即来自动物、植物、微生物和海洋生物的天然产物;④合成与部分合成生物药物。其中①②类属生物技术药物,在我国按“新生物制品”研制申报。③④类视来源不同可按化学药物或中药类研制申报。

二、生物药物的发展

生物药物是一类既古老又年青的新型药物。中国古代劳动人民曾对生物药物的产生与发展做出过重要的贡献,如公元前597年就发明了用(类似植物淀粉酶制剂)治疗消化不良,又如公元11世纪沈括发明的秋石治病更是生物药物早期成功应用的实例。

早期的生物药物多数来自动物脏器,有效成分也不明确,曾有脏器制剂之称。到20世纪20年代,对动物脏器的有效成分逐渐有所了解。纯化胰岛素、甲状腺素、各种必需氨基酸、必需脂肪酸、以及多种维生素开始用于临床或保健。20世纪40~50年代相继发现和提纯了肾上腺皮质激素和垂体激素,使这类药物的品种日益增加。50年代起开始应用发酵法生产氨基酸类药物,60年代以来,从生物体分离、纯化酶制剂的技术日趋成熟,酶类药物很快获得应用。尿激酶链激酶、溶菌酶、天冬酰胺酶、激肽释放酶等已成为具有独特疗效的常规药物。近20年来,生物药物中的生化药物品种迅速增加。全世界已报道的生化药物总计250种左右。改革、开放的20年来,我国生化药物的发展也十分迅速,品种已从70年代的100个发展至今为130多个品种。目前,国外已正式生产的主要品种,我国多数已有产品或正在研制,还独创了一些新品种,如花粉蛋白,人工牛黄等。

自1982年人胰岛素成为用DNA重组技术生产的第一个药物上市以来,生物技术药物的研制与开发取得了飞速的发展。

生物制品最早的实践应用也在我国,例如早在10世纪,我国民间就有种痘预防天花的实践。1796年英国医生琴纳发明了预防天花的牛痘苗,从此用生物制品预防传染病的方法才得到肯定。20世纪以来,随着病毒培养技术的发展,疫苗种类日益增加,制造工艺日新月异。特别是80年代后期,应用基因工程技术研制成功乙肝疫苗、狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗和AIDS病疫苗。使得各种免疫诊断制品和治疗用生物制品也迅速发展,如各种单克隆抗体诊断试剂、甲肝诊断试剂、乙肝诊断试剂、丙肝诊断试剂、风疹病毒、水痘病毒诊断试剂、α-干扰素、γ-干扰素、白介素-2、血凝因子Ⅷ、转移因子等都已相继投放市场。

按照生物药物产品的纯度、工艺特点和临床疗效特征,生物药物的发展大致经历了三个发展阶段。第一代生物药物是利用生物材料加工制成的含有某些天然活性物质与混合成分的粗制剂,如脑垂体后叶制剂,肾上腺提取物,眼制剂,骨制剂,胎盘制剂等。这类产品的特点是有效成分不明确,制造工艺简单,但确有一定的疗效。因此,这类产品在欧亚地区,尤其在第三世界国家和日本等地仍然还有某些新制剂出现。第二代生物药物是根据生物化学和免疫学原理,应用近代生化分离、纯化技术从生物体制取的具有针对性治疗作用的特异生化成分或合成与部分合成的产品,如胰岛素、尿激酶、肝素钠、香菇多糖、前列腺素E、人丙种球蛋白、转铁蛋白、狂犬病免疫球蛋白等。这类产品的特点是成分明确,疗效确切,虽然某些产品的原料来源有限,但随着新的生物活性物质的不断发现,第二代生物药品仍将日益增多,具有广阔的前景。第三代生物药物是应用现代生物技术生产的天然生物活性物质以及通过蛋白质工程原理设计制造的具有比天然物质更高活性的类似物或与天然品结构不同的全新的药理活性成分。如利用基因工程技术生产的人胰岛素、α-干扰素、白介素-2、乙肝疫苗以及用PEG修饰的干扰素等。由于世界各国的技术和资源的利用情况不同,因此上述三代生物药物目前仍处于并存、竞争与相互补充、共同发展的局面。

三、生物药物的特性

1.药理学特性

(1)治疗的针对性强  治疗的生理、生化机制合理,疗效可靠。如细胞色素c为呼吸链的一个重要成员,用它治疗因组织缺氧所引起的一系列疾病,效果显著。

(2)药理活性高  生物药物是从大量原料中精制出来的高活性物质,因此具有高效的药理活性。如注射纯的ATP可以直接供给机体能量,效果确切、显著。

(3)毒副作用小,营养价值高  生物药物主要有蛋白质、核酸、糖类、脂类等。这些物质的组成单元为氨基酸、核苷酸、单糖、脂肪酸等,对人体不仅无害而且还是重要的营养物质。

(4)生理副作用常有发生  生物药物是从生物原料制得的。生物进化的结果使不同生物,甚至相同生物的不同个体之间的活性物质的结构都有很大差异,其中尤以相对分子质量(Mr)较大的蛋白质(含酶)更为突出。这种差异使在用生物药物时表现出副作用,如免疫反应、过敏反应等。

2.在生产、制备中的特殊性

(1)原料中有效物质含量低  杂质种类多且含量高,因此提取、纯化工艺复杂。如胰腺中胰岛素含量仅为0.002%,还含有多种酶、蛋白质等杂质,提纯工艺就很复杂。

(2)稳定性差  生物药物的分子结构中一般具有特定的活性部位,生物大分子药物是以其严格的空间构象来维持其生物活性功能的,一旦遭到破坏,就失去其药理作用。引起活性破坏的因素有:生物性的破坏,如被自身酶水解等;理化因素的破坏,如温度、压力、pH、重金属等。

(3)易腐败  由于生物药物原料及产品均为营养价值高的物质,因此极易染菌、腐败,从而造成有效物质被破坏,失去活性,并且产生热源或致敏物质等。因此生产过程中对于低温、无菌操作要求严格。

(4)注射用药有特殊要求  生物药物由于易被胃肠道中的酶所分解,所以给药途径主要是注射用药,因此对药品制剂的均一性、安全性、稳定性、有效性等都有严格要求。同时对其理化性质、检验方法、剂型、剂量、处方、贮存方式等亦有明显的要求。

3.检验上的特殊性

由于生物药物具有特殊的生理功能,因此生物药物不仅要有理化检验指标,更要有生物活性检验指标。这也是生物药物生产的关键。

四、生物药物的分类、种类

(一)分类

生物药物的分类大致归纳为三种方法:按药物的来源物制造方法分类;按药物的化学本质和化学特性分类;按药物的生理功能和临床用途分类。

(一)按其来源和制造方法对生物药物分类

1.动物来源   许多生物药物来源于动物脏器。近年来,尽管从植物、微生物来源的生物药物逐年增加,但动物来源的生物药物仍占较大比重。尤其是我国,家畜(猪、马、牛、羊等)、家禽(鸡、鸭等)和海洋生物资源丰富,具有大力开展综合利用的条件和资源。

2.微生物来源 应用微生物发酵法生产生物药物是一个重要途径。其优点是:

(1)微生物及其代谢物资源丰富,可开发的潜力很大。

(2)微生物易于培养,繁殖快,产量高,成本低,便于大规格工业生产,不受原料运输、保存、生产季节和货源供应的影响。

(3)微生物发酵法生产生物药物可综合利用,从代谢物和菌丝体都可以制取许多种生物药物,并且通过诱变育种选育良种,或用加入前体培养法大幅度提高产量。

(4)利用微生物体内酶的转化作用进行生物药物的半合成具有重要意义。许多复杂的难以实现的反应,利用微生物酶能专一和迅速地完成。

现阶段利用微生物发酵法生产的生物药物有许多种类。以氨基酸、核酸及其降解物,酶和辅酶等的生产规模较大,其次在多肽、蛋白质、糖、脂、维生素、激素及有机酸的生产上也有不少产品。

3.植物来源 我国药用植物的资源极为丰富。过去在研究药用植物时,往往忽视了其所含有的生化成分,常常把植物中的生物大分子物质当做杂质除去而未能利用。近几年来,对植物中的蛋白质、多糖、脂类和核酸类等生物大分子的研究和利用引起人们的重视,从而出现了许多新的生物药物资源。

4.现代生物技术产品 包括利用基因工程技术生产的重组活性多肽、活性蛋白质类药物、基因工程疫苗、单克隆抗体及多种细胞生长因子,利用转基因动、植物生产的生物药物及利用蛋白质工程技术改造天然蛋白质,创造自然界没有的但功能上更优良的蛋白质类生物药物。利用现代生物技术生产生物药物将是生物药物的最重要来源。

5.化学合成 许多小分子生物药物已能用化学合成或半合成法进行生产。如氨基酸、多肽、核酸降解物及其衍生物、维生素和某些激素。并且通过结构改造以达到高效、长效和高专一性。有些大分子生物药物如酶也可通过化学修饰以提高其稳定性和降低抗原性。

生物药物按其来源不同虽可按上述分类,但许多产品是由几种来源相结合产生的。例如基因工程产品既有动、植物来源,也有微生物来源。甾体激素可视为植物、微生物和化学合成相结合的产物。某些氨基酸和维生素C也是化学合成和微生物发酵相结合的。

(二)按药物的化学本质和化学特性来分

生物药物的有效成分多数是比较清楚的,该分类方法有利于比较一类药物的结构与功能的关系、分离制备方法的特点和检测方法的统一等。因此一般教科书均按此来分类。计有:

1.氨基酸及其衍生物类药物

这类药物包括天然的氨基酸和氨基酸混合物,以及氨基酸衍生物,如N-乙酰半胱氨酸、L-二羟基苯丙氨酸等。

2.多肽和蛋白质类药物

多肽和蛋白质的化学本质是相同的,性质又相似,但分子量不同,在生物学上性质差异则较大,如分子大小不同的物质免疫原性就不一样。蛋白质类药物,有血清白蛋白、丙种球蛋白、胰岛素等;多肽类药物,有催产素、降钙素、胰高血糖素等。

3.酶与辅酶类药物

酶类药物可按其功能分为:消化酶类、消炎酶类、心脑血管疾病治疗酶类、抗肿瘤酶类、氧化还原酶类等。辅酶种类繁多,结构各异,一部分辅酶亦属于核酸类药物。

4.核酸及其降解物和衍生物类药物

这类药物包括核酸(DNA,RNA)、多聚核苷酸、单核苷酸、核苷、碱基等。人工化学修饰的核苷酸、核苷、碱基等的衍生物,如5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤等,亦属于此类药物。

5.糖类药物

糖类药物以粘多糖为主。多糖类药物的特点是具有多糖结构,由糖苷键将单糖连接而成。但由于单糖结构糖苷键的位置不同,因而多糖种类繁多,药理功能各异。这类药物存在于各种生物中。

6.脂类药物

这类药物具有相似的性质,能溶于有机溶剂而不易溶于水,而在化学结构上差异又较大。这类药物,主要有脂肪和脂肪酸类、磷脂类、胆酸类、固醇类、卟啉类等。

7.细胞生长因子类

细胞因子是人类或动物各类细胞分泌的具有多种生物活性的因子。细胞生长因子类药物是近年来发展最迅速的生物药物之一,也是生物技术在该领域中应用最多的产品,如基因工程白细胞介素(IL)、红细胞生成素(EPO)等。它们的功能是在体内对人类或动物细胞的生长与分化起重要调节作用。近10年人们广泛研究的细胞因子有干扰素、白细胞介素、肿瘤坏死因子、集落刺激因子等四大系列十几种细胞因子。

8.生物制品类

从微生物、原虫、动物或人体材料直接制备或用现代生物技术、化学方法制成作为预防、治疗、诊断特定传染病或其他疾病的机制,统称为生物制品。

(三)按生理功能和用途分类

生物药物广泛用作医疗用品,在医学、预防医学、保健医学等领域都发挥着重要作用。按用途分类,大致可分为四大类:

1.治疗药物

生物药物对许多常见病、多发病有着很好的疗效。尤其对于疑难杂症,如肿瘤、艾滋病、心脑血管疾病、免疫性疾病、内分泌障碍等,生物药物的治疗效果是其他药物不可比拟的。因此,治疗疾病是生物药物的主要功能。

2.预防药物

以预防为主是我国医疗卫生工作的一项重要方针。许多疾病,尤其是传染性疾病,如天花、麻疹百日咳等,预防比治疗更为重要。常见的预防药物有菌苗、疫苗、类毒素等。生物药物在预防疾病方面将显示出越来越重要的地位。

3.诊断药物

大部分临床诊断试剂都来自生物药物,这也是生物药物的重要用途之一。生物药物作为诊断试剂的特点是:速度快,灵敏度高,特异性强。现已成功使用的有:免疫诊断试剂、单克隆抗体诊断试剂、酶诊断试剂、放射性诊断药物和基因诊断药物等。一些生物活性物质亦是检测疾病的指标,如谷草转氨酶等。

4.其他生物医药用品

生物药物在其他方面应用也很广泛,如生化试剂、保健品、化妆品、食品、医用材料等。

五、药典及地方标准收载的品种

(A)中华人民共和国药典收载的品种

1.不同年版中华人民共和国药典收载的生物药物品种见表2-1。

表2-1  中国药典收载的生物药物品种

版本

品种数

主要品种或主要新增品种

1953年

14

胰岛素注射液、脑垂体后叶注射液胃蛋白酶胰酶

1963年

18

催产素注射液等

1977年

31

肝素注射液、细胞色素C、注射用玻璃酸酶、注射用绒促性素

1985年

33

胰蛋白酶等

1990年

41

注射用糜蛋白酶、注射用抑肽酶鹅去氧胆酸

1995年

68

尿激酶、凝血酶、氨基酸等

*由于个别品种尚未明确归属,故此品种数仅供参考。

2.1995年版中华人民共和国药典收载的生物药物

1995年中国药典收载的生物技术药物主要有(只列大类,多种制剂):乙酰半胱氨酸人血丙种球蛋白、人胎盘白蛋白、去氢胆酸、甘氨酸、甲状腺粉、丝氨酸、色甘酸钠、抑肽酶、谷氨酸、肝素钠、尿激酶、明胶、吸收性明胶海绵、细胞色素C、玻璃酸钠、胃蛋白酶、亮氨酸、绒白酶、胰酶、硫酸鱼精蛋白、鹅去氧胆酸、缩宫缬氨酸、凝血酶、糜蛋白酶。

3.2000年版中华人民共和国药典新增品种

2000年中国药典拟新增品种主要有:右酐铁、右酐40、70、尿激酶(高单位)、激肽释放酶、门冬酰胺酶辅酶A、辅酶Q10、重组人生长激素、重组人胰岛素等。

(二)卫生部药品标准收载的品种

不同年版部颁标准收载的品种见表2-2

表2-2  不同年版部颁标准收载的生物药物品种

版本

品种数

主 要 品 种

1963年

12

乳酶生、绒膜激素、绒促性素等

1989年

39

三磷酸腺苷二钠、肌苷、肝素钙、尿激酶、弹性蛋白酶、辅酶A、辅酶Q10、溶菌酶、硫酸软骨素等

1998年

106

大豆磷脂、门冬酰胺释放酶等

其中有数种氨基酸已升为药典标准,收载于中国药典1995年版1998年增补本。

(三)省、自治区、直辖市收载的药品标准品种

《中华人民共和国省、自治区、直辖市药品标准汇编》1989年版共收载了1985年10月31日以前地方标准生产的药物3325种,其中生物药物495种,占总数的14.9%。这些品种的一部分现已升到国家部颁标准或药典标准。

(四)国家新批准的生物药物品种

1985年~1998年国家新批准生产的生物药物97种(基因工程药物另统计),主要有:三氮唑核苷、阿昔洛韦、单磷酸阿糖腺苷、尿激酶、蚓激酶、胶原酶、各种处方的氨基酸注射击液、尿促性素、天花粉蛋白、缩宫素(冻干)、中性胰岛素注射液、血卟啉、促肝细胞生长素、果糖二磷酸钠、乳果糖、玻璃酸钠、利巴韦林、肝素钠(乳膏)、沙霉肽酶、抑肽酶、蕲蛇酶、脾氨肽(口服液)、脂肪乳、复合乳酸菌(胶囊)、胸腺五肽低分子肝素钠、胸腺蛋白(口服液)、甘糖酯、海藻酸钙海绵、异丙肌苷等。基因工程药物有18种:生组人α-干扰素1 b 、重组人α-干扰素2α、2 b、重组人g-干扰素、重级组人白介纯素-2、重组链激、重组人碱性成纤维细胞生长因子、重组人粒细胞集落刺激因子、重组人粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子、重组人促细细胞生成素、重组血小板衍生的生长因子、胸苷激酶基因工程细胞制剂、乙肝疫苗、痢疾疫苗等。

(五)目前已批准进入临订研究的生物药物品种

目前已批准进入临订研究和待兹准生产的生物药物品种主在有:牛肺表而活性剂、尿胰蛋白酶抑制剂、柞蚕素、纤维蛋白粘合胶、巴曲酶、胞二磷胆碱(胶囊)、促细胞能肛谢素、磷脂(胶丸)、谷胱甘肽、降钙素、果糖二磷酸钠(胶囊;口服液,海藻酸钾,甲状腺滴眼液、腺原酶、门冬氨酸钙、脑细胞调节不比,前列腺素E、胸腺素  d、胸腺肽D因子、酰半胱氨酸、门冬酸鸟氨酸左旋甲状腺素钠、脲苷等。

六、生物药物的临床用途

(一)作为治疗药物

对许多常见病和多发病,生物药物都有较好的疗效。对目前危害人类健康最严重的一些疾病如肿瘤、糖尿病、心血管疾病、乙型肝炎、内分泌障碍、免疫性疾病,遗传病和延缓机体衰老等生物药物将发挥更好的治疗作用。按其药理作用主要有以下几大类。

1.内分泌障碍治疗剂 如胰岛素、生长素、甲状腺素、胰高血糖素等。

2.维生素类药物 主要起营养作用,用于维生素缺乏症。某些维生素,大剂量使用时有一定治疗和预防癌症、感冒和骨病的作用,如维生素C、维生素D3、维生素B12、维生素B14等。

3.中枢神经系统药物 如L-多巴(治神经震颤)、人工牛黄(镇静抗惊厥)、脑啡肽(镇痛)。

4.血液和造血系统药物 常见的有抗贫血药(血红素)、抗凝药(肝素)、纤溶剂-抗血栓药(尿激酶,组织纤溶酶原激活剂,蛇毒溶栓酶)、止血药(凝血酶)、血容量扩充剂(右旋糖酐)、凝血因子制剂(凝血因子Ⅷ和)。

5.呼吸系统药物 有平喘药(前列腺素、肾上腺素)、祛痰剂(乙酰半胱氨酸)、镇咳药(蛇胆、鸡胆),慢性气管炎治疗剂(核酪注射剂)。

6.心血管系统药物 有抗高血压药(甲巯丙脯酸、激肽释放酶)、降血脂药(弹性蛋白酶、 猪去氧胆酸)、冠心病防治药物(硫酸软骨素A、类肝素、冠心舒)。

7.消化系统药物 常见的有助消化药(胰酶、胃蛋白酶)、溃疡治疗剂(胃膜素、维生素U)、止泻药(鞣酸蛋白)。

8.抗病毒药物 主要有三种作用类型:①抑制病毒核酸的合成,如碘苷、三氟碘苷;②抑制病毒合成酶,如阿糖腺苷,无环鸟苷;③调节免疫功能,如异丙肌苷,干扰素。

9.抗肿瘤药物 主要有核酸类抗代谢物(阿糖胞苷,6-巯基嘌呤,5-氟尿嘧啶),抗癌天然生物大分子(天冬酰胺酶、PSK),提高免疫力抗癌剂(白介素-2,干扰素,集落细胞刺激因子)。

10.抗辐射药物 如超氧化物歧化酶(SOD),2-巯基丙酰甘氨酸(MPG)。

11.计划生育用药   有口服避孕药(复方炔诺酮)和早中期引产药(前列腺素及其类似物,PGE2、PGF2α、15-甲基PGF2α、16,16-二甲基PGF2α)。

12.生物制品类治疗药 如各种人血免疫球蛋白(伤风免疫球蛋白、乙型肝炎免疫球蛋白)、抗毒素(精制白喉抗毒素)和抗血清(蛇毒抗血清)等。

随着生物技术的迅猛发展,新的生物技术药物不断涌现,使生物药物的临床用途得到进一步的扩展。例如胚胎干细胞工程,通过使早期胚胎内细胞团或原始生殖细胞在体外分化,抑制培养,分离和克隆,使其发育成各种高度分化的功能细胞(如肌肉细胞、神经细胞等),并可形成各种组织和器官,从而有望用于修复那些人体已不能再生的坏损组织和器官,并将使许多目前无法根治的疾病得到治愈。又如,反义药物是以反义核酸技术为基础开发的生物技术药物,与传统生物药物相比,反义药物作为治疗药物,其性质、作用对象明显不同,主要表现为:①新的化学物质——寡聚核苷酸;②新的药物受体—mRNA;③新的药物—受体结合后反应。从而使其已逐步应用于癌症治疗、抗病毒、心血管疾病治疗及阿尔茨海默病等各种疾病的治疗方面。

(二)作为预防药物

以预防为主的方针是我国医疗卫生工作的一项重要战略。许多疾病,尤其是传染病(如细菌性和病毒性传染病)的预防比治疗更为重要。通过预防,许多传染病得以控制,直到灭绝,如我国已消灭的天花、鼠疫就是广泛开展预防接种痘苗、鼠疫菌苗所取得的重大成果。

常见的预防药物有菌苗、疫苗、类毒素及冠心病防治药物(如:改构肝素及多种不饱和脂肪酸)。菌苗有活菌苗,死菌苗及纯化或组分菌苗。活菌苗如布氏杆菌病、鼠疫、土拉、炭疽卡介苗等。纯化或组份菌苗如流行性脑膜炎、多糖菌苗,死菌苗如霍乱伤寒、百日咳、钩端螺旋体菌苗等。疫苗也有灭活疫苗(死疫苗)和减毒疫苗(活疫苗)二类。死疫苗如乙型脑炎、森林脑炎、狂犬病和斑疹伤寒疫苗,活疫苗如麻疹、 脊髓灰质炎、腮腺炎、流感、黄热病疫苗等。类毒素是细菌繁殖过程中产生的致病毒素,经甲醛处理使失去致病作用,但保持原有的免疫原性的变性霉素,如破伤风类毒素和白喉类霉素。

近几年发展起来的基因疫苗(genetic vaccination)使作为预防用的生物药物得到进一步发展。基因疫苗也称DNA疫苗,是将外源基因克隆在表达质粒上,直接注入到动物体内,使其外源基因在活体内表达抗原并诱导机体产生免疫应答,产生抗体从而激活免疫力。DNA疫苗已经在许多难治性感染性疾病、自身免疫性疾病、过敏性疾病和肿瘤性疾病的预防领域显示出广泛的应用前景。

(三)作为诊断药物

生物药物用作诊断试剂是其最突出又独特的另一临床用途,绝大部分临床诊断试剂都来自生物药物。诊断用药有体内(注射)和体外(试管)两大使用途径。诊断用药发展迅速,品种繁多,数可近千,剂型也不断改进,正朝着特异、敏感、快速、简便方向发展。

1.疫诊断试剂 利用高度特异性和敏感性的抗体机体反应,检测样品中有无相应的抗原或抗体,可为临床提供疾病诊断依据,主要有诊断抗原和诊断血清。常见诊断抗原有:①细菌类,如伤寒、副伤寒菌、布氏菌、结核菌素等;②病毒类,如乙肝表面抗原血凝制剂、乙脑和森脑抗原、麻疹血凝素;③毒素类,如链球菌溶血素O、锡克及狄克诊断液等。诊断血清包括:①细菌类(如痢疾菌分型血清);②病毒类(如流感肠道病毒诊断血清);③肿瘤类(如甲胎蛋白诊断血清);④抗毒素类(如霍乱OT);⑤激素类(如绒毛膜促性腺激素HCG);⑥血型及人类白细胞抗原诊断血清(包括抗人五类Ig和K,λ轻链的诊断血清);⑦其他类,如转铁蛋白诊断血清。

2.酶诊断试剂 利用酶反应的专一性和快速灵敏的特点,定量测定体液内的某一成分变化作为病情诊断的参考。商品化的酶诊断试剂盒是一种或几种酶及其辅酶组成的一个多酶反应系统,通过酶促反应的偶联,以最终反应产物作为检测指标。经常用于配制诊断试剂的酶有氧化酶、脱氢酶、激酶和水解酶等。已普遍作用的常规检测项目有血清胆固醇、甘油三酯、葡萄糖、血氨、ATP、尿素乙醇及血清SGPT(谷丙转氨酶)和SGOT(谷草转氨酶)等。目前已有40余种酶诊断试剂盒供临床应用,如HCG诊断盒,艾滋病诊断盒。

3.器官功能诊断药物 利用某些药物对器官功能的刺激作用、排泄速度或味觉等以检查器官的功能损害程度。如磷酸组胺,促甲状腺素释放激素,促性腺激素释放激素,胰功肽(BT-PABA),甘露醇等。

4.放射性核素诊断药物 放射性核素诊断药物有聚集于不同组织或器官的特性,故进入体内后,可检测其在体内的吸收、分布、转运、利用及排泄等情况,从而显出器官功能及其形态,以供疾病的诊断。如131碘化血清白蛋白用于测定心脏放射图及心输出量,脑扫描;氰57钴素用于诊断恶性贫血;柠檬酸59铁用于诊断缺铁性贫血75硒-蛋氨酸用于胰脏扫描和淋巴瘤、淋巴网状细胞瘤和甲状旁腺组织瘤的诊断。

5.诊断用单克隆抗体(MCAb)  McAb的特点之一是专一性强,一个B细胞所产生的抗体只针对抗原分子上的一个特异抗原决定簇。应用McAb诊断血清能专一检测病毒、细菌、寄生虫或细胞之分子量很小的一个抗原分子片段,因此测定时可以避免交叉反应。McAb诊断试剂已广泛用于测定体内激素的含量(如HCG、催乳素、前列腺素),诊断T淋巴细胞亚群和B淋巴细胞亚群及检测肿瘤相关抗原。McAb对病毒性传染原的分型分析,有时是唯一的诊断工具,如脊髓灰质炎有毒株或无毒株的鉴别,登革热不同型的区分,肾病综合征的诊断等。

6.基因诊断芯片 基因诊断芯片是基因芯片(Genechip, DNA chip)的一大类,它是将大量的分子识别基因探针固定在微小基片上,与被检测的标记的核酸样品进行杂交,通过检测每个探针分子的杂交强度而获得大量基因序列信息(特别是与疾病相关的信息)。目前主要用于疾病的分型与诊断,如用于急性脊髓白血病和急性淋巴母细胞白血病的分型,以及对乳腺癌前列腺癌的分型及各类癌症或其他疾病的基因诊断。

(四)用作其他生物医药用品

生物药物应用的另一个重要发展趋势就是渗入到生化试剂、生物医学材料,营养、食品及日用化工,保健品和化妆品等各个领域。

1.生化试剂 系列生化试剂品种繁多,不胜枚举,如细胞培养剂,细菌培养剂,电泳与层析配套试剂,DNA重组用的一系列工具酶、植物血凝素,同位素标记试剂和各种抗血清与免疫试剂等。

2.生物医学材料 主要用于器官的修复、移植或外科手术矫形及创伤治疗等的一些生物材料。如止血海绵,人造皮,牛、猪心脏瓣膜,人工肾脏,人工胰脏等。

3.营养保健品及美容化妆品 这类药物已渗入到广大人民的日常生活中,前景可观。如各种软饮料及食品添加剂的营养成分,包括多种氨基酸、维生素、甜味剂、天然色素以及各种有机酸,如苹果酸、柠檬酸、乳酸等。另外众多的酶制剂(如SOD) 、生长因子(如EGF、bFGF)、多糖类(肝素、脂多糖)、脂类(胆固醇、不饱和脂肪酸)和多种维生素均已广泛用于制造化妆品类,包括护肤护发、美容化妆品,清洁卫生劳动保护用品,以及营养治疗化妆品。

五、生化药学与现代药学研学——生物药物的研究发展趋势

(一)   应用生化药学的理论与技术深入发现新的先导化合物

开发新药的物质来源可以是天然资源或合成的化合物,从众多候选化合物中发现具有进一步研究和开发意义的物质,也即先导化合物,是研究新药的起始步骤。一旦发现新结构及特殊药理作用的新药。

从天然产物中发现先导化合物是新药研究的重要方面,尤其是对治疗疑难重症的新药发现更寄希望于天然产物。从天然产物中寻找防治肿瘤、艾滋病、抗病毒、抗衰老、溶栓等药物是新药研究的热点,从各国民间传统药中寻找先导化合物也受到很大重视。

在现有上市药物中,属于天然来源的约占1/4,由于分离技术和结构,极大地丰富了天然产物的来源,现已开发出多种受到临床上重视的新药,如三尖杉酯碱、高三尖杉酯碱、10-羟基喜树碱和9-氨基喜树碱以及由鬼臼毒素衍生出来的VP-16和VM-26等抗肿瘤药物,还有新型抗疟药青蒿素和治疗卵巢瘤等实体瘤的新药紫杉醇以及冠心病防治药银杏黄酮、内酯等。

微生物药物主要包括抗生素和微生物代谢产物。已广泛应用的抗生素至少有100多种;已发现的抗生素达9000多种,人工半合成抗生素、微生物酶抑制剂和免疫调节剂是当前微生物药物的主要发展方向。如HMG-CoA(3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A)还原酶抑制剂洛伐他丁(Lovastatin)的年销售额已达10亿美元;环孢素是有效的免疫抑制剂,对器官移植的抗排斥反应有突出临床效果。在现有微生物药物研究中,抗细菌、抗真菌、抗癌、杀虫等药物所占比例相近,合计约占50%,其他生理活性物质占50%,如图2-1所示。抗癌类(包括抑制蛋白激酶C),抑制肿瘤血管新生作用;循环系统类药物 (包括拮抗内皮素),抑制磷酸二酯酶,抗血小板凝集作用;降血脂类(包括抑制胆固醇酰基转移酶),抑制羟甲基戊二酰辅酶A还原酶;还有抗炎、抗过敏,免疫抑制剂、抗HIV等活性物质。

图2-1  微生物药物研究方向示意

(JAntibiotics)

已上市的生化药物有500多种,还有100多种临床诊断试剂。主要有氨基酸类、多肽蛋白质类、核酸类、多糖类、脂类和细胞因子等。最近在肝细胞生长因子、脑活素神经节苷脂、蚓激酶、蛇毒抗栓酶、低分子量肝素、UTI、肺表面活性物质(PS)和抗菌肽等方面的研究都取得了突出成果,尤其是神经肽和细胞因子的研究进展更为迅速。已发现的神经肽达50种,已成为神经生物学最活跃的研究领域之一。已发现的细胞因子达100多种, 如EPO,TPO,G-CSF,M-CSF,GM-CSF,EGF,NGF,IL-2,IFN,TNF,BDGF等均已在临床应用。从天然产物中寻找具有特殊活性的微量多肽蛋白作为发现新药的先导化合物正方兴未艾,如水蛭素、蜂毒多肽、蜱抗凝肽和犬钩虫抗凝肽A-CAP等均为新型溶栓药物的研究热点。

海洋药物的研究也是新药开发的活跃领域。美国国立肿瘤研究所每年筛选3万个新的 抗癌化合物,有5%来自海洋生物。海洋动物提取物中有10%具有抗癌活性,3.5%海洋植物提取物有抗癌和细胞毒活性。已发现的3万多种海洋生化物质,主要具有抗癌、抗菌、抗病毒、抗艾滋病、降压、防治冠心病、免疫调节与抗衰老等作用。FDA已批准抗肿瘤药物海鞘素、MLD(Manoaliede)和AIF(SCDI鲨鱼软骨提取物的新生血管抑制因子)及海葵素(PIX新型强心剂)进入临床试验研究。

由天然活性物质的深入发现找到结构新颖的先导化合物,设计合成出新的化学实体 (NCE),通过对此类先导化合物的结构与功能的研究可获得大量有效信息,以供设计和研究全新的化学实体。如人体内新的活性多肽的不断发现,使传统的生理调节基础理论发生变化,进一步深化了对某些疾病的病理机制的认识,为新药设计开辟了新途径。对动物与人体的呼吸系统内发现的多种神经肽的研究表明,呼吸功能除受肾上腺素能神经和胆碱能神经的调节外还受非肾上腺素能和非胆碱能神经的调节。此类神经调节系统的递质主要是神经肽。结果从心房中分离到心钠素,从大脑中分离到脑钠素,具有强大的利尿、利钠、降压和调节心律作用,为寻找心血管系统药开辟了新领域。

以天然产物为先导化合物,通过组合化学技术合成大量的结构相关的物质建立有序变化的化合物库供药物筛选和药效关系研究,如根据脑啡肽结构,将除去半胱氨酸以外的 19种氨基酸任意组合成6肽库,合成了总肽数达52128400种,从中筛选鸦片拮抗剂,得到3种强活性多肽;为寻找抗HIV药物,用组合化学法合成筛选了65536种硫代磷酸八聚核苷酸。应用组合化学技术超大量合成和筛选药物的基本原理是在芯片或合成株等固相表面上进行原位合成和原位筛选。除肽类及寡核苷酸外,多糖类小分子化合物的组合化学合成法也取得进展。通过生物新药的研究,结合组合化学技术,为扩大分子多样性,发现先导化合物,创立新的化学实体,找到了一条强有力的新途径。

(二)应用重组DNA技术建立制药工业新门类

应用重组DNA技术和蛋白质工程技术开创了新药研究的新阶段,进而建立了制药工业新门类。未来的生物制药工业将占整个医药产业的1/5。欧美已上市的生物技术药物已达84种,市场销售额已超过195亿美元,2006年将达到320亿美元。已有723种生物技术药物正在通过FDA审批(包括I~Ⅲ期临床和FDA评估),还有700多种生物技术药物处于不同研究阶段。有200个产品已到最后批准阶段(Ⅲ期临床和FDA评估),有80个新品种正在或立即上市。

第一代基因工程药物是针对因缺乏天然内源性蛋白质所引起的一些疾病,应用基因工  程技术去扩大这类多肽蛋白质的产量,主要是以蛋白质激素类为代表的如人胰岛素、胰高  血糖素、人生长激素、降钙素、促生长素(Somatotropin)、α-EPO(Erythropoietin-α)等,以替代或补充体内对这类活性多肽蛋白质的需要。

第二代基因工程药物是根据内源性多肽蛋白质的生理活性物质(主要为细胞因子类,如G-CSF、GM-CSF、α-IFN、g-IFN和tPA等)及其衍生物,应用基因工程技术大量生产这些极为稀有物质,并通过蛋白质工程技术进一步获得自然界不存在的新型基因工程药物,从而为疾病治疗提供了源头性创新的治疗剂。

在实际应用中,基因工程药物受到一定限制,如口服应用时生物利用度低,会受到消 化酶的破坏,在胃酸作用下不稳定,在体内半衰期较短等,因此只能注射给药或局部用 药。为了克服这些缺陷,已开始改为合成这些天然蛋白质的较小活性片段,即所谓“多肽 模拟”或“多肽结构域”合成,又叫“小分子结构药物设计”。用于治疗免疫缺陷症、HIV感染、变态反应性疾病、风湿性关节炎等,其制造成本也更低。这种设计思想业已应用于多糖类药物、核酸类药物和模拟酶的有关研究。小分子药物没计属于第二代结构相关性的合理药物设计,所设计的分子能替代原先天然活性蛋白与特异靶相互作用。

蛋白质的分子设计就是有目的地为制造蛋白质工程药物提供设计方案。应用蛋白质工  程技术已获得多种自然界不存在的新型基因工程药物,如CD4、IL-2与毒素结合的杂合蛋和PIXY321等。蛋白质工程药物的分子设计主要有以下方法:

(1)用突变技术更换活性蛋白质的某些关键氨基酸残基,如将天然 IL-2的125位Cys点突变为Ser,所得的125S-IL-2不会形成二聚体,比活高、热稳定性好、体内半衰期延长,是我国首创的基因工程药物。

(2)通过增加、删除或调整分子上的某些肽段或结构或寡糖链,使之改变活性,生成合适糖型,产生新的生物功能。如将E.coli表达的tPA的A链F、G、Kl 3个结构域除去,只留下A链的K2结构域和B链,从而失去肝细胞识别的A链非糖链的依赖结构,结果半衰期从5~6min上升到11.6~15.4min,这种小分子tPA基因进一步在真核细胞表达,使tPA带有糖链结构,其体内半衰期可达20~25min。

(3)将功能互补的两种基因工程药物在基因水平上融合。这种“择优而取”的嵌合型药物,其功能不仅仅是原有药物功能的加和,还会出现新的药理作用。如IL-6与IL-2融合表达产物CH925除具有IL-6与IL-2的活性外,还可以提高不同级别红系祖细胞的生长。又如GM-CSF/IL-3融合蛋白PIXY321对GM-CSF受体亲和力与天然GM—CSF相同,而对IL-3受体的亲和力却比IL-3高,而且PIXY321在较低EPO条件下能够刺激红系祖细胞BFO-E的形成。

(三)合理药物设计的生化药学理论基础

在过去的药物化学研究中,虽然已更多地注意以构效关系为基础的药物设计,但是化 学和生物医学研究仍然没有很好地融合。在分子层次上对生物大分子的结构与功能研究有了大发展之后,新药研究即步入了合理药物设计的新阶段。以药物作用的靶分子(如酶、受体、通道蛋白、基因组)的结构生物学为基础,为合理药物设计提供了有力的理论基础和技术手段,并成为发现具有独特疗效的化学实体的有效途径。合理药物设计是对靶蛋白进行克隆、表达、分离、结晶、X-射线结构测定、结合NMR与计算机模拟与辅助设计,在原子水平上设计出可以与受体蛋白专一结合或调节受体功能的新化学实体,它大大优越于传统的随机筛选和结构修饰法,是当代新药研究的主流。图2-2简示了合理药物设计药物与受体相互作用及新化学实体的设计与评估的研究过程。

抗高血压药阿托普利(aptopril)就是通过合理药物设计研究成功的。它与血管紧张 素转化酶的活性中心结合,抑制血管紧张素I转变成血管紧张素Ⅱ,防止血管壁收缩,达 到降压作用。药物作用的靶已从以受体蛋白为靶扩大到以酶为靶,以核酸为靶,以多糖为 靶和以通道蛋白为靶的范围。

图2-2 结构相关性的合理药物设计与药物受体相互作用的研究步骤

七、生物药物的研究进展

(一)资源的综合利用与扩大开发

开展综合利用,由同一资源生产多种有效成分,达到一物多用,充分、合理地利用生物资源,不仅可以降低成本,而且可以减少三废,提高药品纯度,减产副作用。

(A)脏器综合利用

动物脏器如胰脏、心脏、肝脏、大脑、垂体等都含有多种激素、酶类、多糖、脂类等生理活性物质。应用现代生化技术可以由同一脏器生产若干产品。例如用心脏可以生产细胞色素C、辅酶Q10;利用肝脏可以生产RNA、SOD等;利用胰脏可以生产胰岛素、胰高血糖素、胰解痉多肽、胰蛋白酶、胰淀粉酶、弹性蛋白酶和激肽释放酶等,同时又可提取花生四烯酸、饱和脂肪酸等脂类及各种氨基酸等。

(B)血液综合利用

人血含有性质和功能不同的多种成分。大多数病人只需要一种成分,很少需要多种成分。因此最好的办法是分离出各种成分,分别对症使用,既可提高疗效、减少副作用,又可充分利用宝贵血源。血制剂按理化性状可分为细胞成分(有形成分)和血浆蛋白成分。前者包括红细胞、白细胞和血小板,后者包括白蛋白、免疫球蛋白、各种凝血因子、纤维蛋白酶原和其他蛋白制剂。

(C)人尿综合利用

人尿是来源丰富的宝贵生物资源。由人尿制取的药物与人体成分同源,不存在异种蛋白抗原性问题。不同生理时期的尿液,所含活性成分有较大不同。如妊娠妇女与绝经妇女尿液可分别制备HCG和HMG,健康男性尿液可以制备尿激酶、激肽释放酶、尿抑胃素、蛋白酶抑制剂、睡眠因子、CSF及EGF、TPO等。

(D) 新资源的开发利用

近几年,新资源的开发利用不断扩大,促使新药研究向纵深发展。其中海洋、湖沼生物、昆虫、毒蛇类和低等生物(如藻类)的开发、研究最引人注目。海洋生物含有抗病毒、抗细菌、抗真菌、抗肿瘤、抗寄生虫、抗凝及对心血管、消化系统、呼吸系统和神经系统有生理作用的物质,这些物质可作为药物原形或直接开发为药物。例如褐藻酸钠(PFS)是一种水溶性杂聚多糖,具有抗凝血、降血脂、解毒、防血栓形成和改善微循环等作用,已开发为药物;以甲壳素的几种水解产物,选取四种氨基酸(L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-缬氨酸、L-苯丙氨酸)以及苯甲酸和乙酰水杨酸作为底物,合成了六个具有较强药效作用的化合物;从紫菜中分离的紫菜多糖,具有提高机体免疫功能,抗肿瘤、抗突变、抗肝炎等作用;从毛等贝类中分离的有效成分,具有补血、降血糖等功能。此外,海蛇多肽可作为神经系统治疗药;从海带中提取甘露醇合成甘露醇烟酸酯用于防治冠心病;鲨鱼油含有环氧角鲨烯、2,3-醇角鲨烯,可作为抗癌剂;从皮中提取抗菌多肽等。

(二)从天然存在的生理活性物质中寻找新的生物药物

已发现的作为药用的生理活性物质仅是机体内存在的活性物质的一小部分,许多新的活性物质正待人们去开发,所以进一步研究尚未发现的新物质和过去不认识的生理作用是寻找新药的另一个重要方向。如从大脑、小脑发现了对记忆、睡眠、控制生育和内分泌等有影响的物质;从动物与人体的呼吸系统内发现多种神经肽,表明呼吸功能除受肾上腺素能神经和胆碱能神经的调节外,还受非肾上腺素能和非胆碱能神经的调节,此类神经调节系统的递质主要是神经肽,结果从心房中分离到心纳素,从大脑中分离到脑钠素,它具有强大的利尿、利钠、降血压和调节心律作用,为寻找心血管系统药开辟了新领域;各类细胞生长调节因子的发现,使免疫调节剂成批出现;还相继发现了许多新的活性多肽,活性多糖和许多不饱和脂肪酸及一些已知成分具有新的药理作用,如加压素有恢复记忆力的作用,催产素有增强性欲的作用,因此国内外新药的研究又趋向于从天然产物中寻找。

(三)利用现代生物技术大力发展生物药物

在现代生物技术领域,医www.med126.com/kuaiji/药生物技术的研究、开发最活跃,进展最快,最有生命力。世界上现在近2000家生物技术公司,其中近70%从事医药生物技术产品的开发。生物技术应用于制药工业,不仅可以生产出大量廉价的防治人类重大疾病的新型药物,而且将引起制药工业技术的重大变革。应用现代生物技术主要研究开发:①生理活性物质,②干扰素,③抗体,④疫苗,⑤抗生素,⑥维生素,⑦医疗诊断制品,⑧其他药品。从事研究的技术领域有发酵技术,基因重组技术、蛋白质工程技术,细胞融合技术,动植物细胞大量培养技术,生物反应器与生化工程设备技术。

(四)利用化学合成技术创制新的生物药物

众多的天然产物除可直接开发成为有效的生物药物外,尚可以由天然活性物质的深入发现找到结构新颖的先导化合物,设计合成新的化学实体。或通过组合化学技术合成大量结构相关物质,建立有序变化的化合物库供药物筛选与药效关系研究。如根据脑啡肽结构,将除去半胱氨酸以外的19种氨基酸任意组合成6肽库,合成了总肽数达52128400种,从中筛选鸦片拮抗剂,得到3种强活性多肽。

许多结构较为简单或分子量不大的天然活性物质可以通过化学合成生产或结构改造形成化合物。如前列腺素PGE2或PGF2α在其15位甲基化即可提高其稳定性许多倍;一些活性多肽的某一氨基酸残基组成当从L-型改为D-型后就可以成为有效的口服药物。

(五)中西医结合创制新的生物药物

中国医药是一个伟大的宝库,我国在发掘中医中药,创制具有我国特点的生物药物方面已取得了可喜成果,如人工牛黄,天花粉蛋白,骨宁注射液,复方干扰素,药用菌和食用菌及植物多糖等都是应用生物化学等方法整理和发掘祖国医药遗产及民间验方开发研制成功的。祖国医药学是几千年来我国人民与疾病作斗争的成果,具有丰富的实践经验,结合现代生物技术,一定可以创制一批具有中西结合特色的新型药物,如应用分子工程技术将抗体和毒素(如天花粉蛋,蓖麻毒蛋白,相思豆蛋白等)相偶联,所构成的导向药物(免疫毒素)是一类很有希望的抗癌药物。

(六)努力提高产品质量,积极开发新剂型,优化产品结构

随着中国加入WTO日期的迫近,各国药品纷纷在中国注册与要求保护。中国生物药物要想在国际竞争中立于不败之地,必须将自己的产品与国外同类型产品作比较,找出自己的差异,其次从生产、工艺、GMP、质量、包装等各个方面努力赶上。在这方面已有一些成功的例子,如我国生产的激肽释放酶,其质量标准经多年的努力从6项增加到12项,产品质量与日本同类产品相比毫不逊色;尿激酶产品的比活性从原来的3.5万IU/mg蛋白提高到10万IU/mg蛋白,比英国药典6.7万IU/mg蛋白提高1/3,其质量标准在世界上居领先地位。这些实例说明老产品的技术水平和质量的提高同样是促进生物药物的发展,提高社会效益和经济效益的关键措施。生物药物新剂型的研究也是优化产品结构的一个重要方面,国外的生物药品往往是一种品种多剂型,系列化生产,利于产品开发。如凝血酶(口服、局部用药)已开发出喷雾剂、气雾剂等4种剂型。在这方面,国内还需努力赶上。

第三章  生物技术药物

一、生物技术药物的定义

生物技术药物(也称基因工程药物,Biotech Drugs),指以DNA重组技术生产的蛋白质、多肽、酶、激素、疫苗、单克隆抗体和细胞生长因子类药物,到目前为止,世界各国利用DNA重组技术成功地生产了人胰岛素、人生化激素、生长因子、r-TPA、干扰素α2a,α2b、β-1b、r-1g、EPD-α、EPO-β,IL-2、G-CSF,GM-CSF等。

自1982年第一个重组药物——人胰岛素上市以来,生物技术药物发展到今也为二代,第一代重组药物是一级结构与天然产物完全一致的药物,第二代生物技术药物是应用蛋白质工程技术制造的自然界不存在的新的重组药物。

新生物技术药物(New biotech drug)是重组产品(Recombinant products)概念在医药领域的扩大应用,并与天然生化药物(Biochemical medicine)、微生物药物(Microbial medicine)、海洋药物(Marine medicine)和生物制品(Biologicals)一起归类为生物药物(Biopharmaceuticals)。随着基因重组药物、基因药物和单克隆抗体的快速发展,生物药物已获得极大的扩充,并与合成药物和中草药并列成为我国的三大药源。现代生物药物已形成四大类型:①基因重组多肽、蛋白质类治疗剂,即应用重组DNA技术(包括基因工程技术、蛋白质工程技术)制造的重组多肽、蛋白质类药物。②基因药物,即基因治疗剂、基因疫苗、反义药物和核酶等。③天然生物药物,即来自动物、植物、微生物和海洋生物的天然产物。④合成与部分合成生物药物。其中①②类属生物技术药物,在我国按“新生物制品”研制申报。③④类视来源不同可按化学药物或中药类研制申报。

二、生物技术药物的主要品种

目前,美国已上市生物技术药物116个,并有723种正在通过FDA审批,还有700多种处于不同研究阶段。

表3-1  欧美已批准的生物技术药物品种

产品

生产厂家

适应症

批准时间

重组血液因子

人重组液因子组Ⅷ(Recombinate)

Baxter Healthcare/Gentics

血友病A

1992(US)

人重组血液因子组Ⅷ(Bioclate)

Institute Centeon

血友病A

1993(US)

人重组血液因子组Ⅷ(Kogenate)

Bayer

血友病A

1993(US)

缺失B结构域的人重组血液因子Ⅷ(ReFacto)

Genetics Institute

血友病A

1999(EU),2000(US)

人重组血液因子组Ⅸ(NovoSeven)

Novo-Nordisk

某些类型的血友病A

1995(EU),1999(US)

人重组血液因子组Ⅸ(Benefix)

Genetics Institute

血友病B

1997(US,EU)

重组水蛭素(Revasc)

Ciba Novartis/Europharm

预防血栓

1997(EU),1997(EU)

重组水蛭素(Refludan)

Hoechst Marion

肝素相关的血小板减少症

1998(US)

tRA(Activase)

Genentech

急性心肌炎

1987(US)

重组tPA(Ecokinase)

Galenus Mannheim

急性心肌炎

1996(EU)

改构重组tPA(Retavase)

Boehringer Mannheim/Centocor

急性心肌炎

1996(US)

改构重组tPA(Rapilysin)

Boehringer Manheim

急性心肌炎

1996(EU)

重组人激素

重组人胰岛素(Humulin)

Eli Lilly

糖尿病

1982(US)

重组胰岛素(Novolin)

Novo Nordisk

糖尿病

1991(US)

一种胰岛素类似物(Humalog)

Eli Lilly

糖尿病

1996(US/EU)

重组人胰岛素(Insuman)

Hoechst AG

糖尿病

1997(EU)

胰岛素类似物(Liprolog)

Eli Lilly

糖尿病

1997(EU)

重组人胰岛素类似物(Noworapid)

Novo Nordisk

糖尿病

1999(EU)

胰岛素类似物,长效胰岛素(Lantus)

Aventis

糖尿病

2000(US)

重组人生长素(Humatrope)

Eli Lilly

儿童生长素缺乏症

1987(US)

重组人生长素(Nutropin)

Genentech

儿童生长素缺乏症

1994(US)

重组人生长素(Bio Tropin)

Biotechnology,General

治疗儿童生长素分泌不足

1995(US)

重组人生长素(Genotropin)

Pharmacia & Upjohn

治疗儿童生长素分泌不足

1995(US)

重组人生长素(Norditropin)

Novo Nordisk

治疗儿童生长素分泌不足

1995(US)

重组人生长素(Saizen)

Serono,Laboratories

治疗儿童生长素分泌不足

1996(US)

重组人生长素(Serostim)

Serono,Laboratories

艾滋病相关的代谢消耗症

1996(US)

重组人高血糖素(Glucagen)

Novo Nordisk

低血糖症

1998(US)

促甲状腺素-α,重组TSH(Thyrogen)

Genzyme

诊断、治疗甲状腺

1998(US)

肿瘤

2000(EU)

人重组FSH(Gonal F)

Ares-Serono

停止排卵和超排卵

1995(EU),1997(US)

人重组FSH(Puregon)

N.Vorganon

停止排卵和超排卵

1996(EU),1997(US)

促卵泡激素-β,重组FSH(Follistim)

Organon

不育症

1997(US)

促红细胞生长因子

重组EPO(Epogen)

Amgen

治疗贫血

1989(US)

重组EPO(Procrit)

Ortho Biotech

治疗贫血

1990(US)

重组EPO(Neorecormon)

重组GM-CSF(Leukine)

Boehringer-Mannheim

治疗贫血

1997(EU)

Immunex

自身骨髓移植

1991(US)

重组GM-CSF(Neupogen)

Amgen

化疗引起的神经炎

1991(US)

重组PDGF(Regranex)

Ortho-McNeil

糖尿病性的皮肤病

1997(US)

Pharmaceuticals(EU)

神经性溃疡

1999(US)

重组干扰素和白介素

重组IFN-α2a(Roferon A)

Hoffmann La-Roche

毛细胞白血病

1986(US)

重组IFN-α(Infergen)

Amgen(US)

慢性丙型肝炎

1997(US)

重组IFN-α2B(Intron A)

Yamanouchi Europe(EU)

毛细胞白血病,生殖器

1999(EU)

Schering Plough

1986(US)

利巴韦林和重组IFN-α2b(Rebetron)

Schering Plough

慢性丙型肝炎

1999(EU)

重组IFN-α2b(Alfatronol)

Schering Plough

乙型、丙型肝炎、肿瘤

2000(EU)

重组IFN-α2b(Virtron)

Schering Plough

乙型、丙型肝炎、肿瘤

2000(EU)

重组IFN-β1b(Betaferon)

Schering AG

多重性肝硬化

1995(EU)

重组IFN-β1b(Betaseron)

Berlex Laboratories and Chiron

治疗和缓解多重性肝硬化和复化

1993(US)

重组IFN-β1a(Avonex)

Biogen

多重性肝硬化

1997(EU),1996(US)

重组IFN-β1a(Rebif)

Ares Serono

治疗和缓解多重性肝硬化

1998(eU)

重组IFN-β1b(Actimmune)

Genentech

慢性肉芽肿疾病

1990(US)

重组IL-2(Proleukin)

Chiron

肾细胞肿瘤

1992(US)

重组IL-11(Neumega)

Genetics Institute

预防血小板减少症

1997(US)

疫苗

重组HbsAg(Recombivax)

Merck

乙肝疫苗

1986(US)

含有HbsAg的二联疫苗(Comvax)

Merck

抗乙型流感和乙肝的疫苗

1996(US)

含有重组的HbsAg的联合疫苗(Tritanrix-HB)

抗乙肝、白喉和破伤风、百日咳的疫苗

1996(EU)

含重组HbsAg的联合疫苗

(Twinrix,adult and pediatric forms)

Smith Kline Beecham

抗甲肝、乙肝的免疫剂

1996(EU), 1997(EU)

含重组HbsAg的联合疫苗(Primavax)

Pasteur Merieux MSD

抗白喉、破伤风、乙肝的疫苗

1998(EU)

含重组HbsAg的联合疫苗

(Procomvax)

Pasteur Merieux MSD

抗乙型流感、抗乙肝

1999(EU)

重组Osp A(Lymerix)

Smith Kline Beecham

莱姆病疫苗

1998(US)

单克隆抗体

  对淋巴瘤CD3的单抗(Orthoclone

OKT3)

Ortho Biotech

肾移植,急性同种异体移植排斥的免疫抑制剂

1986(US)

  对TAG-72的单抗(OncoScint CR/OV)

Cytogen

结肠和卵巢癌的检测、肿瘤分类和随访检查

1992(US)

  对血小板表面受体的抗原结合片段

(ReoPro)

Centocor

预防血凝

1994(US)

  针对与肿瘤CA125抗原片段

(Indimacis 125)

CIS Bio

诊断卵巢腺癌

1996(EU)

  针对与人CEA癌的抗原片段

(CEA-scan)

Immunomedics

检查直肠癌的复发、转移

1996(US)

  针对胃贲门及肌球蛋白的单抗

(MyoScint)

Centocor

心肌检测成像剂

1996(EU)

  针对肿瘤表面抗原PSMA的单抗

(ProstaScint)

Cytogen

前列腺癌的检查和随访

1996(US)

  针对HMW-MAA的抗原的混合单抗

(Tecnemab K1)

Sorin

皮肤黑色素瘤损伤的诊断

1996(EU)

  针对癌相关抗原的单抗片段(Verluma)

Boehringer Ingelheim/

neoRx

小细胞肺癌检查

1996(US)

  针对NCA90的一种粒细胞非特异性交叉抗原的单抗片段(LeukoScan)

Immunomedics

感染性和非感染性骨髓炎的诊断

1997(US)

  针对B淋巴细胞表面CD20的单抗

(Rituxan)

Genentech/IDEC Pharmaceuticals

非霍奇金淋巴瘤

1997(US),

1997(US)

  针对IL-2受体的α-链的

Mab(Zenzpax)

Hoffmann La-Roche

预防肾移植排斥反应

1999(EU),

1998(EU)

  针对IL-2受体的α-链的

Mab(Simulect)

Novartis

预防同种异体移植的排斥反应

1998(EU)

  定向TNF-α的嵌合型Mab

(Remicade)

Centocor

局限性回肠炎

1999(EU)

  针对艾伯特呼吸器多胞体病毒的表面

抗原的人源化Mab(Synagis)

Albbott(EU)

1999(EU)

  人源化抗体,针对HER2即表皮生长

因子的抗体(Herceptin)

Genentech

治疗HER2蛋白过分表达,乳腺癌逆行转移

1998(EU)

  人源化抗体,针对肿瘤相关抗原的

Mab(Humaspect)

Organon Teknika

癌症诊断

1998(EU)

  针对CD20的单抗(Mabthera)

Hoffmann La-Roche

诊断非霍奇金淋巴瘤

1998(EU)

其他产品

  重组DNAse (Pulmozyme)

Genentech

囊性纤维变性

1993(US)

  重组β-葡萄糖脑苷酯酶(Cerezyme)

Genzyme

治疗脑苷脂沉积症

1997(EU)

  重组TNF-α(Beromun)

Boehringer Ingelbeim

继肿瘤转移后的延缓切除术的辅助治疗

1999(EU)

  rIL-2与毒素的融合蛋白,靶向表面有

IL-2受体的细胞(Ontak)

Seragen/Ligand

Pharmaceuticals Immunex(US)

皮肤T细胞淋巴瘤

1999(US)

1999(US)

  重组TNF-IgG片段(Enbrel)

Wyeth Europa (EU)

类风湿性关节炎

2000(EU)

  反义寡核苷酸(Vitravene)

ISIS Pharmaceuticals

治疗艾滋病患者的巨细胞病毒,视网膜炎

1998(US)

我国已批准上市的生物技术药物有IFN-α1b,IFN-α2a,IFN-α2b,IFN-γ,IL-2,IL-2-125Ser,G-CSF。GM-CSF,r-SK,EPO,EGF,EGF衍生物,bEGF,胰岛素,GH,TPO,TNF衍生物,抗IL-8单抗乳膏剂,胸苷激酶基因工程细胞制剂,乙肝疫苗,痢疾疫苗共21种。

我国已有生物制药生产企业200多家,有生产能力的60多家,已生产21个品种,年产值达40多亿元,正逐年上升,并开始注意产业的群落化与集约化,如生物谷、生物城、生物医药城、生物岛等正在逐步建立。我国主要采取“立足创新、集成应用、需求导向和重点突破”的战略,对成熟技术,进行多学科、多领域的集优,走“官、产、学、研、资”相结合的发展体制,力争使我国生物医药产业成为国民经济的支柱产业。

通过10多年的跟踪研究与创仿相结合的开发阶段,目前我国的生物技术药物研究已开始步入自主创新的时期,并以“新型生物技术药物和疫苗”作为发展重点。

表3-2  我国已批准生产的生物技术药物和疫苗

名 称

适应证或作用

生产单位

rhu IFNα 1b (外用)

病毒性角膜炎

长春生研所

rhu IFNα 1b

乙肝、丙肝

深圳科兴、上海生研所、北京三元基因

rhu IFN2α

乙肝、丙肝、疱疹等

长春生研所、长生药业、三生药业,新大洲药业辽宁卫生生物,上海万兴生物

rhu IFN2α(酵母)

乙肝、丙肝

rhu IFNα 2b

乙肝、丙肝、白血病等

安科、汉生、华新、鼎力、策远、华立达、英特龙、里西哈尔、长春生研所

rhu IFN2α(栓剂)

妇科病

武汉天奥药厂

rhu IFNα 2b(凝胶剂)

疱疹等

合肥科大兆峰药厂

rhu IFNγ

类风湿

上海生研所、克隆、丽珠

rhu EGF(外用)

烧伤、创伤

大江、长生药业、四环

EGF衍生物

烧伤、创伤

深圳华生元

rhu IL-2

癌症辅助治疗

沈阳三元、长生药业、金泰、长春生研所、瑞德制药、四环、金丝利、深圳科兴、华新、康利制药、白鹭园

rhu IL-2125Ser

癌症辅助治疗

上海华晨

rhu G-CSF

刺激产生白细胞

厦门特宝、杭州九源、白鹭园、长春金赛、苏州中凯、三维、北海方舟、山东科兴、新鹏、格兰百克、齐鲁制药、成都蓉生、里亚哈尔、华北制药、泉城、九九艳阳、汉进制药

rhu GM-CSF

刺激产生白细胞

骨髓移植

厦门特宝、华北制、北医联合、里亚哈尔、海南华康、顺德南方、上海海济、金赛、山东医生所、鑫金焱、淮南福寿、华晨、上海生化、上海华新

rhu EPO

产生红细胞

三生制药、华欣药业、克隆、山东科兴、成都地奥、阿华、四环生物

rhu GH

矮小病

金赛、安科、恒通、医进、联合赛尔

bFGF(外用)

创伤、烧伤

珠海东大、长生药业

RSK

溶血栓(心梗)

复兴实业、金泰

抗IL-8单抗乳膏剂

银屑病

东莞宏远逸士公司

人胰岛素

糖尿病

通化东宝、医进、科兴

乙肝疫苗

预防乙肝

深圳康泰、北京生研所、华北制药厂

痢疾疫苗

预防痢疾

兰州生研所、军科院

三、生物技术药物的研究发展趋势

生物技术药物的市场占有品种明显增加,主要品种类型有疫苗、单克隆抗体、细胞因子、激素、抗血栓因子、基因治疗剂与反义药物等。以核酸为基础的基因药物品种快速增加,正在进行临床试验的反义药物已超过30种。近6年来批准的生物技术药物数量是此前13年的3倍,最近4年批准的新药总数是此前15年的总和。2000年批准了32个新药,是1982—1993年11年的总和。1982~2000年共批准生物技术药物175个,其中新药116个,老药新适应证59个。

在过去10年,生物技术新药上市率一直居于新药研究的榜首。20世纪90年代共批准 370个新药,其中49个是生物技术药物(占13%)。据EMEA统计,1995年有127个新化学实体药物批准用于临床,其中生物技术药物为44种(占34%)。进行临床试验的生物技术药物,在1988年为81种,1993年143种,1996年284种,到2000年已达369种。由此可见,生物技术药物在未来医药工业经济中占有重要地位。

1.生物技术药物的发展已进入蛋白质工程药物的新时期

第一代重组生物技术药物逐步被第二代所取代,蛋白质工程技术日新月异,点突变技术、融合蛋白技术、定向进化、基因插入及基因打靶等技术使蛋白质工程药物新品种迅速增加。

通过蛋白质工程手段可以提高重组蛋白的活性,改善制品的稳定性,提高生物利用度,延长在体内的半衰期,降低制品的免疫原性等。如天然胰岛素制剂在储存中易形成二聚体和六聚体,延缓了胰岛素从注射部位进入血液,从而延缓了降血糖作用,也增加了抗原性。这是胰岛素B23-B28氨基酸残基结构所致,改变这些残基,则可降低聚合作用,使胰岛素快速起作用。蛋白质工程技术在单抗人源化和制造融合蛋白方面也发挥了重大作用。当然蛋白质工程产品也有潜在缺点,如可能因结构与天然蛋白不同而增加免疫原性或降低了生物活性与治疗价值或改变了药效学和药代动力学性质,因此临床研究时,应特别仔细观察。

2.新的高效表达系统的研究与应用

从基因工程药物表达的研究策略看,迄今为止,已上市的生物技术药物(DNA重组产品)多数是在E.coli表达系统生产的(34种);其次是CHO细胞(14种)、幼仓鼠细胞(2种)以及酿酒酵母菌(11种),正在进一步改进的重组表达系统有真菌、昆虫细胞和转基因植物和动物。转基因动物作为新的表达体系之所以更令人关注是因为能更便宜地生产复杂产品。Genzyme,Transgenics(Framingham MA),PPL theraputics(Edindurgh UK)和Pharming (Leiden,the Netherlands)等产品已进入临床试验(主要有α1-抗胰蛋白酶,α-葡萄糖苷酶和抗凝血酶Ⅲ),还有20种产品正在用转基因山羊、绵羊或牛进行早期开发。实现用转基因动物进行生物技术蓟物生产,用于医疗已指日可待,通过克隆动物用于生物技术药物生产也具有发展前景,如用克隆羊使其带有人Ⅸ因子基因,用于制备IX因子。

3.将基因组和蛋白质研究成果转化为生物技术新药的研究与开发

蛋白质组学是研究细胞内全部蛋白质的表达方式和功能方式的学科。蛋白质组学研究的兴起,标志着生命科学研究水平进入高通量和整体性研究结段,因为蛋白质具有自身的特殊活规律,如后修饰加工,转运定位,结构形成,蛋白质与蛋白质之间、蛋白质与核酸的相互作用等。这些均不可能从细胞水平或基因水平上研究获知。通过蛋白质组学研究,可以探索蛋白质在质量、功能、相互作用及关联网络系统的整体性、时控性和调控性,从而揭示机体的生理与病理过程,因此蛋白质组学的研究将为新药的研发提供强大的物质基础。 

蛋白质组学的研究内容包括:①发现疾病特异相关蛋白,如肿瘤相关标志蛋白,可用作肿瘤诊断和治疗药物的作用靶标。②研究不同个体、不同生理病理状态下药物代谢酶谱的变化,为药代动力学和临床提供专一依据,从而发展个性化用药途径。⑧研究药物不良反应、毒副作用方面的蛋白质组学,为合理用药提供依据,从而建立个体的蛋白质组数据库,用于患者的蛋白质谱分类和执行个性化用药。④应用蛋白质组学技术,从传统中药中寻找天然活性物质,为实现中药现代化提供生物技术手段,如对昆虫毒素的系统活性分析,可以找到提供DNA重组生产的目的蛋白及其功能基因。

4.研究与开发生物技术蓟物的新剂型

生物技术药物多数易受胃酸及消化酶的降解破坏,其生物半衰期也普遍较短,需频繁注射给药,造成患者心理与身体的痛苦。即使皮下或肌内注射,其生物利用度也较低。另外多数多肽与蛋白质类药物不易被亲脂性膜所摄取,很难通过生物屏障。因此生物技术药物的新剂型发展十分迅速,如对药物进行化学修饰,制成前体药物,应用吸收促进剂,添加酶抑制剂,增加药物透皮吸收及设计各种给药系统等。主要方向是研究开发方便合理的给药途径和新剂型:①埋植剂缓释注射剂,尤其是纳米粒给药系统具有独特的药物保护作用和控释特性。②非注射剂型,如呼吸道吸入、直肠给药、鼻腔、口服和透皮给药等。

(1)埋植剂  微型渗透泵埋植剂,其外形像胶囊的埋植剂,植入后,体液可透进外壳,溶解夹层电解质层,使夹层的体积膨胀,压迫塑性内腔,使药物从开口处定速释出,已有肝素、胰岛素和NGF等埋植剂在动物体内外的研究报道。

可注射的埋植剂,以生物降解聚合物作为埋植剂或注射型缓释剂的骨架,常用的有2类:①天然聚合物,如明胶、葡聚糖、白蛋白、甲壳素等o②合成聚合物如聚乳酸、聚丙交酯、聚乳酸翻羟乙酸(PLGA)、聚丙交酯乙交酯(PLCG)、聚己内酯、聚羟丁酸等。其中PLGA在体内降解为乳酸、羟乙酸进一步分解为C02和H20具有良好生物相容性,无免疫原性,安全性高,并可通过聚合单体比例和聚合条件调节聚合物在体内的降解速度,其应用越来越广泛。Zenica公司研制成功Zoladex注射型埋植剂,将多肽药物戈舍瑞林(goserelin)与 PLGA熔融混合,经一多孔装置挤出直径为1mm和条状物切成小段,单剂量3.6mg,灭菌后,密封于一次性注射器内待用。可供皮下或肌肉内注射用。

(2)微球注射剂  有多种注射型微球的制备方法,如相分离法、复乳-液中干燥法、喷雾干燥法、低温喷雾提取法、熔融挤出法等。

四、国内临床使用的主要生物技术药物简介

(一)乙型肝炎疫苗

乙型肝炎病毒(HBV)感染已是人类健康的严重威胁。据调查,我国国民中乙肝病毒携带者平均达到8.83%,全国约有一亿以上人口为无症状乙肝病毒携带者;有乙肝病人约2700万,每年发病人数在百万以上。除因乙肝病毒感染导致慢性活动性肝炎和肝硬化等而引起死亡外,在肝癌患者中,约有80%是由乙肝病毒感染引起的。因此预防乙肝感染对我国来说,是关系子孙后代健康和振兴中华大业的紧迫任务。根据现有的病毒携带率,预计从20世纪90年代初起,在疫苗目前已能保证充分供应的条件下,积极推行计划免疫,进行母婴阻断接种,那么也要到21世纪中业才有可能使我国的病毒携带率降至现在的一半以下。由此可见,在我国,控制乙肝传播须经过几代人的努力,是一项非常严峻而艰巨的任务。

20世纪70年代初开始使用乙肝表面抗原(HBsAg)阳性血清制备乙肝疫苗预防乙肝病毒感染,开创了病毒尚不能在实验室繁殖的情况下制备疫苗的先例。但这种血源疫苗存在一些问题,如血源有限、成本较高、带有一定的潜在性危险等。特别是近年来艾滋病流行,血液制品易受HIV污染,致使乙肝血源疫苗的使用在一些国家受到限制。然而乙肝血源疫苗的生产和使用,说明HBsAg的主蛋白可以诱生良好的保护性抗体,使人免受 HBV的侵袭,这一事实为研制乙肝第二代疫苗奠定了良好基础。基因工程技术的飞速发展,使基因工程乙肝疫苗的研制成为可能。

(A)重组乙肝疫苗

20世纪80年代以来,国内外学者应用基因工程试图制成乙肝疫苗,做了大量工作。比较成功的有以下几条研制路线:①使用哺乳动物细胞表达HBsAg,大体上分为两类:一是用SV40早期启动子调控乙肝病毒表面抗原基因,以dhfr为扩增基因构建的质粒转染CHO-dhfr-细胞,选出高产HbsAg的细胞系用于制备乙肝疫苗;二是用m-MT或h-MT为启动子调控乙肝病毒表面抗原基因,以BPV为扩增基因构建的质粒转化为小鼠乳瘤细胞C-127,选出高产HbsAg的细胞系,用其分泌的HbsAg纯化后制备疫苗。这两种方式分别在法国和美国研制成功。第一种方式在我国也研制成功,投入生产;②使用病毒载体组建重组病毒以表达HBsAg,用作活疫苗或灭活疫苗,如用痘苗病毒载体。我国组建了不经传代细腻的重组病毒株VTH-2,它是以天然株为起始株的带乙肝表面抗原主蛋白基因的毒株(adr亚型HBsAg基因)。现已投入试生产;③使用重组酵母生产乙肝疫苗,即用DNA重组技术构建的重组酵母菌表达HBsAg,然后经过分离纯化制成疫苗,我国已引进美国Merck公司的技术投入试生产。

[1]重组乙肝表面抗原疫苗(酵母)

简称“重组酵母乙肝疫苗(Recombinant HBsAg Vaccine(Yeast))。

1.结构与性质

HBsAg的基本结构是P24多肽链,它由226个氨基酸组成。以溴化氰裂解可产生5个肽段。其中80个氨基酸序列和位点已确认,与DNA序列编码的氨基酸相符合。本品电泳结果只在分子量20000—25000之间有一条主带,这条主带有HBsAg特异性,且未糖基化,不存在HBsAg中P27糖基化带。电镜检查结果表明本品的阳地与血源疫苗一样,均为22nm的球形颗粒。

2.临床应用

本品系由重组酵母合成的乙肝表面抗原经纯化、灭活及吸附后制成,用于预防所有亚型的乙肝病毒感染,它与血源性乙肝疫苗具有同样的效力和保护效果,但不含任何人血清成分,故更安全,更易为人们所接受。接种对象是乙肝易感者,包括婴幼儿、儿童和因职业关系接触乙肝病毒的成年人。但主要接种对象为婴幼儿。接种对象应为乙肝病毒表面抗原阴性和转氨酶正常者,接种于上臂三角肌内。接种程序和用量如表2-5。

表3-3  重组酵母乙肝疫苗接种程序和用量

接种人群

疫苗规格

选定接种日期

1个月后

6个月后

新生儿、儿童和成人

5μg/0.5ml

0.5ml

0.5ml

0.5ml

接种重组酵母乙肝疫苗所产生的抗体与接种血源乙肝疫苗产生的抗体具有类似的免疫学性质和化学性质,这两种乙肝疫苗在健康人群中产生相同的抗体谱,因而这两种疫苗可以互换使用。使用血源性乙肝疫苗进行第一或第一、第二针免疫接种的人,可以用重组酵母疫苗完成第二、三针或第三针免疫接种,反之亦然。

已经患有肝炎、急性传染病或其他严重疾病者禁用。对酵母或疫苗中任何成分过敏严、禁用。注射时应备有肾上腺素,当过敏反应发生时使用。每一接种对象必须使用单独的注射器和注射针头,以防止乙肝病毒和其他致病因子的相互传染。用前摇匀,有摇不散块状物不得使用。

3.副作用

本品一般没有严重的副反应,偶有注射部位红肿或疼痛,发烧或头痛。都为一过性反应。

[2]重组乙肝表面抗原疫苗(CHO细胞)

简称“乙肝基因疫苗”(recombinant HBsAg vaccine(CHO cell))。

1.结构与性质

乙肝病毒包膜蛋白的基因有三个基因序列,共用一个终止密码,因而该基因的翻译蛋白产物有三种:①HBsAg的主蛋白,有226个氨基酸;②中等蛋白,在主蛋白的N端,另有55个氨基酸;③大蛋白,含389—400个氨基酸。本晶主要是HBsAg的主蛋白,含226个氨基酸。电泳结果表明除有分子量为23000和27000两条特异性蛋白区带外,尚有三条糖蛋白区带即GP30及其二聚体、多聚体,共五条区带,都具有活性。

纯化的HBsAg在CsCI中浮力密度为1.20~1.22,电镜检查HBsAg颗粒是均匀的,有时存在少数大或小的空心颗粒。5+端氨基酸序列分析结果与编码碱基序列完全相符。

2.临床应用

本品用于预防乙型肝炎。接种对象是乙型肝炎易感者(表面抗原阴性、转氨酶正常),主要用于婴幼儿。一般易感者(婴儿、儿童和成人)每次注射lml(10μg),免疫间隔为零月(注射当时)、一月、六月共三针。三针后1个月100%抗体阳转。用于高危病人如肾透析病人及其他与乙肝密切接触者,可用20μg/lml剂型。用于母体HBsAg阳性(特别是e抗原阳性)的新生儿,应在出生后48h内注射,用20μg/lml剂型。注射间隔同上,亦可与乙肝高价免疫球蛋白(HBIG)联合使用。

本品注射时要充分摇均,注射部位为上臂三角肌内。对患有肝炎、发热、急性慢性严重疾病或有过敏史者禁用本品。如有安瓿破裂、变质或有摇不散的块状物不得使用。本品贮存过程中严防冻结。

(B)新型乙型肝炎疫苗

20世纪80年代早期开始的乙型肝炎(HB)疫苗接种无疑取得了巨大成功,在广泛使用阳疫苗的人群中,HB发病率显著下降,近十几年来,已证明HB疫苗安全有效,共有高度免疫原性,90%以上的接种者达到保护性抗-HBs水平,所有成功接种者(抗-HBs水平>10U/L)都能抵抗HB。并且该疫苗耐受性良好,从未观察到明显由该疫苗引起的严重不良反应。

然而,HB疫苗的一些缺点阻碍了它的应用。全程免疫需接种3次疫苗,这会降低免覆盖率;1%~10%的健康者对疫苗应答不佳,该百分率在老年人中保持恒定;另外,伺可能逃避现有疫苗保护作用的HBsAg突变株存在争论。鉴于这些原因,目前正在研制新的更好的HB疫苗,以增强疫苗的免疫原性,简化HB疫苗接种。

[1]改进现有疫苗的方法

1.联合疫苗

HB疫苗可与其他疫苗(尤其是儿童期疫苗)联合使用,这样只需一针注射,其结果无疑会提高疫覆盖率。HB与DTP或甲型肝炎与乙型流感杆菌(Hib)联合疫苗已有一些国家应用,目前正在开发DTP、HB、脊髓灰质炎和Hib联合疫苗。

2.单剂疫苗

人们正在用控释微粒技术研制单剂疫苗。该法是利用灭活疫苗一针注射诱导强的长期免疫应答。将疫苗包裹于无反应性且能很好耐受的可生物降解聚合物(聚丙交酯—聚乙交酯)中。疫苗依其在这些微球内的分布于不同时间点释放出不同的量,这样可模拟不同时间间隔接种数剂疫苗。动物实验已获成功:1剂含HBsAg的微粒诱导的免疫应答几乎与不同时间接种3剂的常规HB疫苗相同。

3.口服疫苗

含HBsAg编码基因的重组沙门菌实验疫苗可在小鼠中诱导抗—HBs应答。今后的方法是研制表达HBsAg的转基因植物(如香蕉等)作为可食用疫苗。

[2]增强HB疫苗免疫原性的方法

1.新递释系统

目前正在对几种增强HB疫苗免疫原性的方法进行研究。第一种是使用替代的递释系统:正在对新佐剂进行检测,痘苗、腺病毒或沙门菌等重组微生物正在被用作感染后的表达宿主,并诱导其特异性免疫力。

2.新佐剂

为增强免疫缺陷者(如血液透析病人)的免疫应答,用Q或了干扰素作为常规疫苗的佐剂已取得一定成功。Meuer等将白细胞介素—2与疫苗一起注射的预试研究已取得较好结果。然而,Jungers的大规模对照研究不能证实这些结果。实验性新佐剂单磷酸脂质A的临床试验结果比常规疫苗略好。

3.重组活载体

迄今,对重组活载体只进行过动物实验。Moss等对含HBsAg基因的重组痘苗病毒的试验表明,该疫苗能保护黑猩猩抵抗HB病毒的攻击。然而,痘苗病毒副作用大,不能用于人类。

(二)干扰素

A.干扰素的定义

1980年国际干扰素命名委员会正确定名为interferon,简写为IFN,定义如下:干扰素是一类在同种细胞上具有广谱抗病毒活性的蛋白质,其活性的发挥又受细胞基因组的调节和控制,涉及RNA和蛋白质的合成。

目前认为,干扰素是一种类似多肽激素的细胞功能调节剂,是一种细胞素,其含义如下:

第一,干扰素必须是一种蛋白质,它对蛋白酶类是敏感的,而对DNA酶或RNA酶却有抵抗能力。天然干扰素是一种糖蛋白,采用DNA重组技术由大肠杆菌表达的人干扰素多肽不带糖分子。

第二,这种蛋白质的结构基因与调节基因广泛地存在于脊椎动物或更高等动物的细胞内。在一般生理状态下,细胞的干扰素基因呈静止状态,只有在特定诱生剂的作用下。细胞的干扰素基因才活动转录合成相应的mRNA,进而转译出具有种属特异性的干扰素蛋白。

第三,干扰素本身并不能直接灭活病毒,干扰素作用于细胞后,使后者又产生多种其他蛋白质(抗病毒蛋白),从而阻断病毒的繁殖。

第四,干扰素必须具有广谱的抗病毒活性。如果某一种抗病毒物质仅对特定的病毒有作用,就不能称为干扰素。

B.干扰素的种类和命名

干扰素在生物界的分布是很广泛的,不仅人和高等动物的有关细胞能产生干扰素,而且许多低等动物、昆虫、植物和细胞也能产生干扰素,概括起来可以分为人干扰素、动物干扰素、昆虫干扰素、植物干扰素和细胞干扰素五大类。国际上对人和鼠干扰素提出了一种新的命名法,根据抗原特异性和分子结构的不同分为α、β、γ三型,在命名法中还规定:①若今后继续发现新干扰素,则在IFN右侧标以δ、ε等即可;②若要表示IFN的来源,则在IFN左侧标明种或属的缩写或全名即可,如HulFN(人干扰素)、MulFN(鼠干扰素)、BovlFN(牛干扰素);③若要区别不同细胞产生的同一型干扰素,则可在该型干扰素缩写名称的右侧括弧内标以细胞名的缩写即可,如HulFN-α(Le)为α-人白细胞干扰素、HuIFN-α(Ly)为α-人淋巴细胞干扰素;④若在今后发现某些类型的干扰素在其蛋白质多肽链上的氨基酸排列顺序有差异,则还可再分亚型,如HuIFN-α1,HuIFN-β2;⑤若要表示分子量的不同,则可将分子量标在其缩写名右侧括弧内,如HuIFN-α(18000),HulFN-β(38000)等。

近年来随着基因工程技术的发展,基因工程干扰素研制成功,为了区分基因工程干扰素和自然干扰素,则分别以rlFN和nlFN表示。

C.干扰素的基本特性及其作用特点

干扰素的基本特性主要有以下几点:

(1)种属特异性  即所有的干扰素,都有较严格的种属特异性,所谓“种属特异性”即指某一种属的细胞所产生干扰素只能作用于相同种属的其他细胞,使其获得“免疫力”。例如人干扰素只对人体有保护作用,而对其他动物就没有保护作用。但也有例外,如猴干扰素除对猴有保护作用外,对人亦有一定的保护作用。

(2)作用广谱性和选择性  广谱性即指干扰素作用于机体有关细胞后,可使其获得抗多种病毒和其他微生物的能力。选择性即指干扰素仅作用于异常细胞,对正常细胞的作用很小。

(3)相对无害性  干扰素已广泛应用于临床,但到目前为止还未发现它对人体有什么严重的副作用,在临床应用干扰素治疗时即使有时会出现些不良反应,但一经停药后,即可迅速恢复正常,均属可逆反应。

(4)特殊稳定性  α、β干扰素一般在60℃条件下放置1h也不会被灭活,γ干扰素可于56℃被灭活,纯晶可在低温下(—20℃以下)长期保存,若加入适量的人血白蛋白等稳定剂,则效果更好。

α、β干扰素对酸性pH相当稳定,γ干扰素在pH为2的情况下不稳定。

D.干扰素的生物活性

1.抑制病毒繁殖活性

干扰素具有广谱抗病毒活性,它在同种细胞或机体内,对多种病毒包括DNA病毒、RNA病毒、引起肿瘤的病毒或不引起肿瘤的病毒都有一定程度的抑制作用,但是抑制程度却因病毒种类而千差万别,甚至同一病毒的不同血清型对干扰素的敏感性差别也很大。干扰素的抗病毒作用,并不是靠干扰素本身去直接“中和”或“抑杀”病毒,而是间接地通过细胞产生“抗病毒蛋白”发挥作用的。干扰素的抗病毒活性有相对的种属特异性。

干扰素的抗病毒作用表现为病毒繁殖量的减少,以及由此而引起的细胞损伤的减少。干扰素可以阻断病毒颗粒的复制,减少病毒数量,使显性感染变成不显性感染,对一般病毒感染可以促进机体恢复,缩短病程。

2.抑制细胞分裂活性

干扰素在试管内和在机体内对细胞生长有抑制作用,产生这一作用的干扰素量要比抑制水泡性口炎病毒(VSV)繁殖的有效剂量大30倍,对生长快的细胞远比对生长慢的抑制作用要强。干扰素对迅速分裂的肿瘤细胞有选择性的抑制作用,这对防治肿瘤有十定意义。

干扰素的抑制细胞分裂活性也有相对的种属特异性。

干扰素抗肿瘤作用的机制并不是单一的,是综合性的,据目前所知,除干扰素直接抑制肿瘤细胞的生长外,还有抑制肿瘤病毒的繁殖和调动机体免疫系统杀伤肿瘤细胞,促进巨噬细胞的吞噬,引起肿瘤细胞迅速被破坏减少的功能。干扰素可以抑制抗抗体反应,从而可能降低肿瘤保护抗体的水平,使免疫系统更有效地作用于肿瘤。干扰素可以改变肿瘤细胞的细胞膜,以增加肿瘤特异性组织相容性抗原的表达,以利于杀伤清除肿瘤细胞。干扰素可增进NK细胞活力,这一点可能是干扰素抗肿瘤作用的最为重要的一个原因。

3.免疫调节活性

(1)免疫系统细胞产生干扰素

免疫系统细胞产生干扰素的主要类型是γ亚型以及酸不稳定性α亚型,也有少量的α亚型或β亚型。详见表3-4。

表3-4  免疫系统细胞所产生的干扰素

在试管内的刺激物

产生干扰素的细胞类型

产生的干扰素类型

有丝分裂

各种细胞(有或无巨噬细胞辅助)单核细胞,B细胞,无效细胞

γ,α以及少量的酸不稳定性α

免疫个体的抗原刺激

OKT4阳性T细胞,B细胞

γ,酸不稳定性α

肿瘤细胞

非T,非B,LGL(大颗粒淋巴细胞)

γ,α

自发

LGL,OKT4阳性T细胞

γ,酸不稳定性α

(2)干扰素对效应细胞的影响

①增强组织相容性抗原和某些受体的表达。一定浓度的干扰素可增强淋巴细胞表面组织相容性抗原、β-2微球蛋白及IgG、Fc受体的表达,从而调节许多免疫反应,包括免疫复合物的清除,吞噬作用和依赖抗体的细胞毒作用。干扰素对巨噬细胞的功能有增进作用,并可调节T、B细胞功能。

②干扰素可增加NK细胞的活性,α、β、γ干扰素均能刺激NK细胞对肿瘤细胞系和新分离的肿瘤细胞的细胞毒作用,而有效地保护正常细胞免受NK细胞的杀伤。干扰素增加NK细胞活性包括两个方面,一是激活NK细胞前体,二是增加被溶解的细胞谱。

③干扰素与其他细胞因子关系也相当密切。外周血单核细胞在有丝分裂素刺激下,不仅可以诱生γ干扰素,同时产生其他细胞因子,如白细胞介素-2(重L-2)、淋巴毒素(LT)等。目前所知,IL-2参与IFN-γ产生的调节机制,而IFN对激活的T细胞产生IL-2也是必需的。部分纯化的IFN-γ可以增加IL-2受体,而T细胞的增殖是依赖于IL-2受体的表达和密度的。纯化的IL-2可以增加有丝分裂素刺激淋巴细胞诱生IFN-γ,这说明IFN-γ与IL-2在功能上是紧密联系的。干扰素对免疫功能的调节作用归纳于表3-5。

表3-5  干扰素的免疫调节活性

作用系统

对免疫反应的调节

T细胞

主要抑制,有时增进

B细胞

主要抑制,有时增进

巨噬细胞

增进

NK细胞

增进

补体水平

下降

移植免疫

延长同种移植物的排斥反应

干扰素的生物功能本质归纳为图3-1。

E.干扰素的临床应用

a.干扰素的临床适应证

1.急性病毒性感染

(1)常见多发病  流感及其他上呼吸道病毒性疾病、流行性结膜炎、病毒性角膜炎、病毒性流行性腹泻病毒性心肌炎单纯疱疹感染、水痘、带状疱疹流行性腮腺炎等。

(2)死亡率高的病毒病  乙型脑炎、狂犬病、小儿病毒性肺炎等。

2.慢性病毒性感染

这类疾病可能是由于干扰素系统功能损害所致,包括慢性活动性肝炎、巨细胞病毒性感染。

3.恶性肿瘤

(1)去除原始肿瘤后,进行防止转移的预防性治疗,如成骨肉瘤等。

(2)对用病毒学或免疫学方法早期诊断的肿瘤,在临床症状出现以前进行早期治疗,如鼻咽癌原发性肝癌

(3)各期恶性肿瘤

4.器官移植患者

由于器官移植患者使用免疫抑制药物,所以易患病毒性感染,使用干扰素可以防止病毒感染和抑制对同种异体移植物的排斥。

b.干扰素的生物活性对防治病毒性疾病和恶性肿瘤的作用

干扰素防治病毒性疾病的作用见表3-6。干扰素治疗病毒性和其他非肿瘤疾病的疗效见表3-7。干扰素的生物活性对治疗恶性肿瘤的作用见表3-8,对治疗肿瘤的疗效见表3-9。

表3-6  干扰素对防治病毒笥疾病的作用

干扰素的活性

对防治病毒性感染性疾病的作用

阻断病毒颗粒的复制

1.减少病毒量,使显性病毒感染变成不显性感染

2.促进感染的恢复,缩短病程

3.由于抗原量的减少,可以减轻抗体-抗原复合物所致的组织损伤

4.阻止病毒DNA整合到细胞DNA中去

对免疫系统的调节作用

1.   当大量病毒存在时,由于抑制B细胞功能,可能减少有害的免疫复合的形成

对T-B细胞抑制作用

2.   由于病毒在激活淋巴细胞内繁殖较好,抑制细胞功能,有助于抑制病毒繁殖

对巨噬细胞促进作用

对NK细胞促进作用

3.   可以增强对巨噬细胞和NK细胞的促进作用,可以促进杀伤带有病毒的受染细胞

对细菌的抑制作用

防止细菌继发感染

表3-7  干扰素治疗病毒性和其他非肿瘤疾病的疗效

病 毒 病

病 原

疗 效

1.慢性活动性乙型肝炎

HBV

约40%患者Hbe阴转,与激素联合用可以提高疗效

2.丙型肝炎

HCV

约25%~50%患者ALT下降或正常

3.艾滋病

HIV

抑制艾滋病患者HIV的复制;延长HIV带毒无症状者发病的潜伏期,Kaposis肉瘤可以缓解,增加血清β2M水平,与AZT联合应用可以改善症状

4.唇和生殖器官复发性疱疹

HSV-1

缩短病程,减轻疼痛

HSV-2

5.带状疱疹

VCV

缩短病程,阻止扩散,减轻病痛

6.肿瘤患者水痘

VCV

降低致命性的内脏合并症

7.病毒性角膜炎

HSV-1腺病毒

缩短病程,减少复发,痊愈率>90%

8.结膜炎

肠道病毒70

缩短病程

9.慢性宫颈炎(包括宫颈湿疣)

HPV,HSV,CMV

局部应用60%显效,95%有效

10.肛门-生殖器扁平湿疣

HPV

40%~50%治愈率

11.青年喉乳头状瘤

HPV-11

肿瘤消失或缩小,易复发

12.寻常疣

HPV

改善

13.巨细胞病毒病

CMV

尿毒症消失,降低发病率

14.普通感冒

HRV

缩短病程,排毒减少

15.外阴前庭炎

50%与HPV有关

改善临床症状

16.Behet’s病(征)生殖器溃疡、口疮及眼色素层炎

不明

干扰素治疗后,口、生殖器溃疡结节性红斑血栓性静脉炎、复发性关节炎等均可减轻症状或完全消除,但是眼色素层炎,视神经乳头炎无改善,停药后复发

17.类风湿性关节炎

不明

γ-干扰素治疗后,疼痛明显减轻,40%~50%缓解

18.多发性硬化

不明

延长缓解期

19.精神分裂症

不明

部分改善

20.呼吸道合胞病毒感染

RSV

志愿者试验表明,攻击前后均给药,可以明显减轻症状,但仅在病毒攻击后给药,则无效。

表3-8  干扰素对治疗肿瘤的作用

干扰素活性

对治疗肿瘤可能的作用

抗肿瘤病毒繁殖活性

1.   防止肿瘤病毒基因整合到细胞DNA中去,可防止细胞转化

2.   去除原始肿瘤灶后,防止肿瘤转移

抗细胞分裂活性

抑制肿瘤细胞的生长,延长或阻止肿瘤的发展

免疫调节作用:

促进巨噬细胞功能

促进NK细胞活性

抑制B细胞功能

促进杀伤肿瘤细胞

降低封闭抗体水平,有利于杀伤肿瘤细胞

增加淋巴细胞组织相容性抗原的表达

增加细胞毒作用

表3-9  干扰素治疗肿瘤的疗效

肿  瘤

疗  效

肿  瘤

疗  效

1.毛细胞白血病

60%~90%缓解

9.恶性黑色素细胞癌

10%以上部分或完全缓解

2.慢性白血病

50%部分缓解

10.卵巢癌

10%以上部分缓解

3.淋巴瘤

37%部分或完全缓解

11.乳腺癌

10%以上部分缓解

4.Kaposis肉瘤

26%部分或完全缓解

12.恶性胰腺肿瘤

部分改善

5.急性白血病

24%部分缓解

13.晚期直肠癌

部分改善

6.多发性骨髓病

20%部分或完全缓解

14.食管癌

部分改善

7.神经胶质瘤

17%部分或完全缓解

15.非小细胞性肺癌

部分改善

8.肾细胞癌

16%部分或完全缓解

16.小细胞性肺癌

部分改善

F.目前临床上使用的各种类型干扰素

a.人干扰素α1b(humanreconbinant interferon α1b)

1.简称

rHu IFN α1b

2.商品名

Referon、干扰素、悦复能。

3.结构与性质

本品是由166个氨基酸残基组成的多肽,内含5个Cys,形成二条二硫键,Cys空位的存在易使二硫键错配,形成聚合体,聚合体的活性仅为单体的十分之一。

本品分子量理论值19392,等电点在5~6之间有多条导电聚焦电泳带,说明其等电点的不均一性。对酸十分稳定,在pH2的溶液中亦不会失活,利用这一性质有利于纯化。对各种蛋白酶十分敏感,很易失去活性。

4.临床应用

(1)本品具有广谱的抗病毒作用,目前用于治疗乙型和丙型肝炎、治疗乙型肝炎具体方法如下:

甲组:400万U/次,肌内注射,·每日一次,连用3个月。

乙组:400万U/次,肌内注射,每日一次,连用一个月后改为400万U/次,隔日一次,连用2个月。

全部病例治疗前及治疗后每月检测一次:血清I-IgsAg、BeAg、抗Hge、HBV-DNA。治疗前及治疗开始后每2周检测1次肝功能、血常规、血小板、尿常规、尿素氮等指标。

肝功能:甲组26例治疗前血清ALT异常者,治疗后14例复常(53.85%),乙组19例治疗前血清ALT异常者治疗后7例复常(36.84%),两组复常率经统计学处理无显著性差异(P>0.05)。

结果表明:两组HBsAg、HBV-DNA阴转率无显著性差异。而HBsAg阴转率两组存在显著性差异。(P<0.05)。

干扰素αlb已大规模用于,临床,但其剂量仍在探讨中。上述两组剂量均取得一定疗效。但HBsAg阴转率两组存在显著性差异,甲组优于乙组。这与国外学者主张的大剂量连续使用是一致的。

本品的副作用为低热、皮疹等,其副作用显著低于进口干扰素。但疗效与进口干扰素相似。

治疗丙型肝炎的方法与乙型肝炎相似,但以大剂量即每天注射400万U以上连续3个月~6个月疗效较好。经干扰素αlbl2周治疗后,有50%的丙型肝炎病人ALT恢复到正常水平,这一疗效是其他任何药物所不及的,所以目前干扰素是治疗丙肝的首选药物。

(2)本品用于治疗毛细胞白血病11例,每天注射60μg,连续2至6个月,总有效率为63.4%,低于国外报道的有效率80%。可能与所用剂量低和延续时间(应为12个月)短有关。

(3)本品还可用于治疗疱疹、宫颈炎、结膜炎、尖锐湿疣等。局部应用,疗效显著。

(4)规格:lO μg、20 μg、30 μg三种冻干粉针。

(5)贮藏:4~8℃冰箱,避光贮存。

b.人干扰素α2a(humanrecombinantinterferonα2a)

1.简称

rHulFN α2a。

2.商品名

罗扰素、抗病肽、因特芬、Roferon-A。

3.结构与性质 .

本品是由165个氨基酸组成的单链多肽,Cysl和Cys98、Cys29和Cysl38组成两条二硫键。其中29~138之间的二硫键对干扰素生物活性更为重要。在pH2.5的溶液中稳定,对热也稳定。对各种蛋白酶敏感。分子量理论值为19219,等电点在5~6之间。分子中无糖。比活性达2×108U/mg蛋白。

4.临床应用

本品具有很多天然的人类Q干扰素制剂的特性。体外试验表明,对不同人体肿瘤有抗增生作用,对裸鼠之人体肿瘤移植有抑制作用。这种作用已在毛细胞白血病和卡波济肉瘤患者中获得证实。毛细胞白血病一般剂量为每天300万U,持续16~24周。维持剂量为300万一500万U,每周三次,肌注或皮下注射。卡波济肉瘤一般剂量为首3天每天300万U,第4~6天每天900万U,然后增至可耐受的最高剂量,每周3次,肌注或皮下注射,可用药至肿瘤完全消失。

本品与细胞表面的特殊受体结合后,刺激细胞产生2’,5’-寡腺苷酸合成酶、dsRNA-dependent蛋白激酶、Mx蛋白等。这些产物会抑制病毒蛋白质合成,抑制病毒核酸的转录和分解病毒的RNA核酸。另外本品可以调节免疫力,可以影响细胞膜表面抗原的表达,也可以影响很多免疫中间物质的细胞膜受体表达,此外还可以影响细胞毒性T细胞和自然杀伤细胞及B细胞作用。以上这些作用可用于治疗乙型和丙型肝炎,一般剂量为300万U,每周三次,皮下注射,如在3~4月后病情未获改善,可考虑停药。

本品用于治疗慢性乙型肝炎(CHB)已有多年的历史。CHB患者由于乙肝病毒(HBV)持续存在,致使机体细胞和体液免疫功能紊乱,造成肝细胞的免疫损伤和肝脏慢性活动性炎症,IFN-α具有抗病毒和调节免疫功能的双重作用,用于治疗CHB可获得50%左右的长期疗效。

IFN-α的抗病毒作用并不是直接作用于病毒,而是通过诱导感染HBV的细胞产生一类蛋白质发挥效能。这些蛋白质又称抗病毒蛋白(AVP)。AVP主要有3种:①蛋白激酶:可使分子量67000和35000两种多肽发生磷酸化,其中35000多肽是合成多肽的启动因子,经磷酸化失活后,导致病毒合成的抑制;②2’,5’-寡腺苷酸合成酶:能在双股RNA作用卞,使ATP聚合成寡腺苷酸,激活细胞内的核苷酸酶F,使mRNA降解,从而阻断病毒蛋白的合成;③磷酸二酯酶:能降解2’,5’-寡腺苷酸,还能去除tRNA的pCpCpA末端,抑制病毒蛋白的翻译,从而达到抗HBV的作用。

IFN-α对HBV的作用只限于复制型由HBV-DNA,并不能清除细胞核内的车制模板cccDNA,亦不能清除已与宿主DNA整合的病毒基因,故难以使其表达的HBsAg消失。同时,它只是在HBV大量复制,并引起细胞炎症应答时才发挥其最大抑制效应。

IFN-α还具有抗细胞分裂活性及免疫调节活性,它通过调节细胞免疫、体液免疫来调节机体的防御功能,它还可以增强肝细胞膜上的HLA-1类的抗原表达,使TC增强识别HBV感染的肝细胞并破坏它。IFN-α还可抑制有丝分裂原,促使T细胞增殖,还可增强巨噬细胞活性,并通过调节K细胞和NK细胞活性来调节机体免疫监视功能。

当IFN-α治疗CHB开始后,其血清中HBV-DNA水平很快下降,是其直接抗病毒作用的结果。疗程第6~8周时部分病人ALT升高,则可能是IFN-α激活了宿主的免疫应答,破坏了感染HBV的肝细胞所致。由于IFN-α抑制了HBV的复制,减少了靶抗原的产生,IFN-α又同时激发了宿主的免疫反应,清除了HBV,从而缓解了肝脏炎症的活动,使ALT下降。

(1)治疗病例的选择 目前尚无准确方法判定IFN-α对于哪些CHB治疗有效,哪些患者治疗后不复发,IFN-α对哪些病人治疗有害无益,因而选择用IFN-α治疗的病例应谨慎。因为IFN-α对于HBV的作用,只限于复制型的HBV-DNA,当病毒复制导致肝脏炎症应答时,IFN-α才产生抗病毒和免设调节效应,所以一般认为轻症、早期或非活动性CHB患者,暂不宜使用IFN-α。对失代偿的乙型肝炎肝硬化或中度以上黄疸的CHB,虽然血清中HBV-DNA阳性,但IFN-α可使肝小叶炎症激活或炎症加重,不易为衰竭的肝脏所耐受,往往导致病情加重或死亡,所以不宜用IFN-α治疗。另外,当发生自身免疫性肝病时,肝炎病毒血清标志物可出现假阳性,此时若予IFN-α治疗则往往使病情加重,故应注意鉴别。

CHB选择IFN-α治疗的依据:①ALT中度升高;②血清HBsAg、HBeAg、HBcAb阳性;③血清HBV-DNA阳性;④血清高滴度HbcAb-IgM;⑤肝组织病理检查为慢性活动型肝炎;⑥或伴有血清抗HDV-IgM阳性;⑦或伴血清抗HCV-IgM、HVC-RNA阳性。

(2)剂量和疗程 经前瞻性对照研究,用IFN-α 100万U、300万U、500万U、1000万U皮下或肌肉注射,隔日一次或每周3次,疗程3~6月。相比之下,1000万U有最高的反应(血清HBV-DNA、HbeAg消失)、随后临床症状及血清生化指标缓解,肝脏活动性炎症缓解,但不能耐受的病例增多。而100万U效果最差,有效病例很少,所以不宜推广。疗程16周与24周效果相似,后者复发略为减少。因此,IFN-α治疗CHB的最低剂量是300万U,肌肉注射隔日一次或每周3次,最适宜的剂量是500万U肌肉注射,隔日二次或每周3次,疗程不少于16周。

(3)疗效和复发 CHB经IFN-α 300万U肌注,隔日一次或每周3次治疗3~4个月后,约有50%病人可获完全效应。表现为HBV-DNA消失、HBsAg阴转、ALT稳定正常、肝小叶炎症和碎屑样坏死减轻。随访5~7年,患者病情大多稳定。其HBV-DNA消失时间多在5个月之内,HBeAg多在10个月内清除。ALT恢复稳定正常多在13个月以内,可有50%左右HBeAb阳转。而HBeAg被清除者仅占15%~20%。且多在治疗后1~2年,这多见于感染时间较短和年龄较大的病人。

CHB病人经IFN-α治疗后,即使获得完全效应者,亦不等于HBV被完全清除,其中仍有10%~20%病例在1~2年内感染再活动。复发表现是ALT升高、HBV-DNA阳转,或HBeAb逆转为HBeAg。其主要原因是CHB病人经IFN-α治疗后,HBV以低水平保留在肝内或外周单核细胞中,因自发或免疫抑制或使用细胞毒药物,或因其他病毒感染 (如HIV、流感等)的激发而再活动。其次是由于HBV变异(主要是前CA83变异株)。其特点是HBV-DNA和HBeAb同时存在。对复发病例应首先排除病毒的重叠感染后,再考虑是否因IFN-α治疗不充分引起。如重复使用IFN-α治疗CHB,对复发病例一般仍有良好效果。

(4)IFN-α治疗CHB疗效预测因素

CHB临床表现形式很多,HBV血清标志物表现亦不尽相同,加之IFN-α价格昂贵,疗效亦仅50%左右,远期复发率仍高,且有一定的非适应证,所以不是所有CHB病人均为IFN-α的治疗对象。根据近期多种报道,下列诸条可作为IFN-α治疗CHB疗效预测因素:①CHB病活动期者效果好(表现为ALT高值,HbcAb-IgM阳性,肝组织活检肝小叶内炎症浸润和伴有碎屑样坏死);②血清HBV-DNA水平低者效果好(>200pg/ml者多难奏效);③病程短于4年或伴有急性黄疸型肝炎病史者效果好;④IFN-α治疗后,血清与外周单核细胞2’,5’-寡腺苷酸合成酶增多10倍以上者效果好;⑤血清β2-微球蛋白(胆MG)在IFN-α治疗2周后迅速升高(>226mg/L)者效果好;⑥T4/T8比值在IFN-α治疗后显著升高者效果好;⑦成人无其他合并症者效果好;⑧IFN-α在疗程中,早期出现干扰素抗体者效果差;⑨HBV垂直感染、婴幼儿时期感染者、男性、同性恋者效果差。

IFN-α治疗慢性HBV感染,目前虽被推荐为首选药物,但其抗病毒效果仍欠理想,且影响IFN-α疗效的因素众多,所以必须严格选择病例,熟悉IFN-α性能,合理地确定使用剂量和疗程,注意药物的副作用,留取IFN-α治疗病例前、中、后血清进行HBV标志物及复制水平的监测和IFN-α抗体检查,及时调整IFNα的剂量或类型,才能更好地提高治疗效果。

使用本品的初期,可能会有几天的头痛、发热、寒战、乏力、倦怠、肌痛、食欲减退等流感样症状。在临睡前注射会更容易适应这些症状所引起的不适。使用本晶偶有白细胞减少或血小板减少的现象,则要非常小心地处理,要定期做这两项指标的检验,一般而言,在停药后即会恢复正常。

下列病人禁止使用本晶:①已知对药物或其他干扰素有过敏史;②患有严重的心脏疾病;③患有严重的肝肾疾病;④有癫痫和中枢神系统功能不佳;⑤孕妇。

5.规格

1×106,3×106,5×106U三种规格,均为冻干粉针剂,用时加1 ml注射用水。

6.贮藏

贮于2~8℃,本药不含防腐剂,故应避免污染,每瓶药物只供一次取用。

C.人干扰素α2a(humanreconbinant interferon α2b)

1.简称

rHuIFNα2b

2.商品名

InteronA,干扰能

3.结构与性质

本品是申165个氨基酸残基组成的多肽。它与rHuIFNα2a在结构上仅差一个氨基酸,即在第23位不是Lys而是Arg,其余结构均相同,因此,性质也基本相同。

4.临床应用

本品在临床前期用细胞培养系统及动物体内人体肿瘤异种移植之研究表明具有抗增生作用,在体外试验亦表明有明显的免疫调节活性。此免疫调节活性可增强巨噬细胞的吞噬作用,同时增强淋巴细胞对靶细胞的特殊细胞毒性,这些作用可用于治疗多发性骨髓瘤、卡波济肉瘤、恶性黑色素瘤、毛细胞白血病及喉乳头状瘤。使用剂量为300万U~500万U,隔日皮下注射一次。疗程根据相病种而异,卡波济肉瘤5天为一疗程,其他病需一个月到三个月不等。若有不良反应发生,应调整剂量或暂停用药。若病人不能耐受或病情恶化,则停用本品。

本品与细胞膜上特殊受体结合后,能发挥细胞活性,诱导某些酶的作用,阻止受病毒感染细胞中病毒复制与增殖,起到抗病毒活性,用于治疗慢性乙型肝炎、丙型肝炎等。每日剂量300万U,持续一个月,然后隔日皮下注射100万U~300万U,至3个月到半年。剂量和疗程视病人耐受情况而调整,若发生严重不良反应应停止用药。

本品副作用轻微且具可逆性,若与放射疗法或其他抗癌药共用,可起协同作用。对乙型肝炎的治疗,一般在先服用泼尼松等激素治疗一个月后,再注射本品疗效更佳。为了缓解因用本品引起的发烧及头痛症状,可在注射本品前30min服用对乙酰氨基酚500mg。

本品不良反应除发烧、头痛外,还包括寒战、食欲缺乏、恶心、腹泻、背痛、嗜睡、低血压等。这些反应是可逆的,一般在停药72h后消失,且反应的轻重与用药剂量有关。

本品不能用于心脑血管病人,如有心肌梗死史和心律不齐的病人,孕妇禁用。

5.规格

1×106, 3×106两种规格,均为冻干粉剂。

6.贮藏

贮存于4~8℃冰箱。

d.人干扰素γ(human recombinant interferon γ)

1.简称

rHuIFNγ

2.结构与性质

本品含有23个氨基酸残基的信号肽,由143个氨基酸组成,分子量为16775,在氨基酸水平上与干扰素α和β 99%差异,且在分子中无Cys,故无二硫键,因此本品的性质与干扰素α和β差异也很大,对酸很不稳定,对热稳定性也很差。由于结构中碱性氨基酸占多数,故其等电点偏碱性,约为pH 8.6以上。分子中分为两个片段:氨基端片段与羟基片段,这种结构与其活性有密切的关系。此外,本晶的C端是不齐的,可被蛋白水解酶在Arg,Lys及其他氨基酸的地方多处水解,形成不同长度的分子,但它们大多数都有活力。

天然γ干扰素是一种糖蛋白,它在第25位和97位Asn处有两个N糖基化位点,而大肠杆菌表达γ干扰素无糖基化,但研究证实仍具有生物学活性。

3.临床应用

本品除有抗病毒和抑制细胞生长活性外,主要是对免疫系统的作用,它的免疫调节功能包括激活巨噬细胞,促进各种免疫细胞的成熟与淋巴因子的分泌,诱导I、II型MHC基因的表达等,尤其是近年来发现γ干扰素对类风湿性关节炎疗效甚佳,更扩展了本品的临床应用前景。目前进行临床应用的适应证有宫颈瘤、生殖器疣、慢性肉芽肿和病毒感染及其他某些肿瘤。

本品用作皮下或肌内注射,生殖器疣亦可采用病灶基部注射,一般用量为106U/日,疗程视不同疾病由医师决定。常见的副反应为发热和疲劳感,其他如厌食、局部疼痛等,副反应均为一过性和可逆性。治疗期间观察白细胞计数、肝功能变化。凡有明显过敏体质、特别是对抗生素有过敏史者,应慎用,必须使用时应先用本晶做皮肤试验,阴性者可使用。严重心脏病或肾脏病患者、癫痫和其他中枢神经系统功能紊乱者及孕妇严禁使用本品。安瓿有裂缝、破损不能使用,如有摇不散块状物或絮状物均不得应用。

4.规格

1×106在一种规格。

5.贮藏

2~8℃暗处保存。

G、干扰素的药理作用及临床应用的研究发展

(a)干扰素受体的研究

干扰素受体的存在,是干扰素通过细胞发挥其生物学功能的一个重要条件。目前所知,根据抗原性将干扰素分为α、β、γ三型。干扰素的受体主要存在于细胞膜,受体对干扰素的结合,也有高嗜性和低嗜性之分,其只有与靶细胞上的高亲和力受体特异结合才发挥生物学效应。干扰素激活细胞的机理主要是通过与细胞膜受体结合引起干扰素基因激活因子活化,启动于干扰素激活基因转录,合成一些具有特殊功能的蛋白质,从而发挥效应作用。

近年来研制成功高度亲和性的人IFN-γ受体特异性单抗,与毒素、放射性同位素、化疗药物联结后可作用于相应的肿瘤细胞,使之与受体结合,从而杀伤或抑制肿瘤细胞。预计此种导向疗法可应用于治疗某些肿瘤、自身免疫性疾病、移植排斥反应等。

关于干扰素对细胞受体的调节,尤其是IFN-γ对TNF以及LT和IL-2受体的表达都有正调节作用,因此在临床试治研究中,越来越重视多种细胞因子的协同应用。

(b)干扰素的临床应用研究

干扰素的研究可以大体分为下面几个阶段:①1957年人类发现干扰素;②20世纪60年代寻找到新城鸡疫病毒(NDV)和仙台病毒等高效干扰素诱生剂;③20世纪70年代研制成功人白细胞干扰素、人成纤维细胞干扰素和人类淋巴细胞干扰素,不仅可以批量生产而且可应用于临床,被认为是当代抗病毒、抗肿瘤的一种最有希望的治疗制剂,受到临床界的重视;④20世纪80年代基因工程干扰素研制成功,仅就α干扰素而言,就有四十多个国家应用,被批准治疗的病种达二十多种,像对人类危害比较大的疾病如:慢性活动性肝炎、丙肝、丁肝、毛细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、多发性骨髓瘤、淋巴瘤等疾病,都获得较满意疗效。

目前对于扰素的应用研究包括以下方面:

1.干扰素基因疗法

如将IFN-γ基因转移人细胞毒性T淋巴细胞(CTL)中,并证明此种CTL的抗肿瘤作用显著强于常规CTL。

2.人工新型干扰素的研究

(1)抗病毒活性增强的新型IFNs  例如用点突变技术将重组IFN-β第17位氨基酸残基上的游离Cys换为Ser,结果IFN-β Serl7的抗病毒活性比重组IFN-β高10倍。新型人IFN-γ也有类似特性,抗病毒活性比原人IFN-γ提高4~50倍。

(2)稳定性增加的新型IFNs  最典型的例子是IFN-β Serl7,与nIFN-β相比,其稳定性明显增加。NIFN-β,在-70℃保存75d抗病毒活性大量丧失,而IFN-β Serl7在同样条件下贮存150d,其抗病毒活性没有改变。新研制的rIFN经50℃处理,其活性丧失极小,可保持原来活性的81%~98%。

(3)调节NK细胞活性增强的新型IFNs 最令人鼓舞的是IFN-αD新型杂合体对鼠NK细胞活性的调节作用比亲本IFN提高了10~400倍。

(4)抗原性改变的新型IFNs  大多数IFNs类似物和杂合体都具有与亲本IFN相同的抗原性,然而,若IFN-β1 141位上的Cys被Tyr取代,不能形成二硫键时,这种新型干扰素的抗原性发生改变,就不再与自然IFN-β1竞争抗体。

(5)种属特异性改变的新型IFNs  对新构建的IFN-αA和D杂合体研究时发现,IFN-αD在牛MDBK细胞中相对活性最高;IFN-αA在人MG2767细胞系中相对活性最高,而它们的杂合体IFN-α2(B) α1(1FN-αAD)则在鼠L929细胞中相对活性最高,完全不同于两个亲本。

3.关于用药策略

对于IFNs的用药,有的专家提出四方面的策略值得考虑:

(1)聚射用药策略 所谓聚射就是把干扰素直接导人“靶灶”内。如外露的实体瘤可用“浸润注射法”将干扰素直接注入瘤体内或用导管引入(如脑神经胶质瘤);若靶灶在内脏,则可采用“磁力导航法”将干扰素导人靶灶内。

(2)联合用药策略 在干扰素与抗病毒药物联合应用中,现已发现,有些起“协同作用”,有些起“相加作用”,有些起“拮抗作用”,因此在与有关药物联合应用时,事前最好弄清这些情况。

(3)联合治疗策略 就是指以某种独特的疗法配合另一种独特的疗法,以期达到更好的疗效。如手术疗法对实体瘤体的治疗亦是目前公认的一种疗法,但当某些实体瘤正在发展进行时(如瘤体的边缘界限模糊不清时),就不宜进行手术,但这时可用高浓度干扰素治疗,使其稳定下来(如瘤体缩小,边缘清楚等),这就可能为手术创造了有益的条件。

(4)调量用药策略  就是指干扰素的治疗用量要“辨病而定”,而不可千篇一律地只求量或只主张用低剂量。近年来亦发现,低浓度的干扰素可增强NK细胞毒活性,局浓度的干扰素则抑制NK细胞毒活性。

(三)白细胞介素-2

A.白细胞介素-2(IL-2)

a.  IL-2的产生和生物学特性

1.IL-2的产生

IL-2是辅助性T细胞受丝裂原或抗原刺刺激后,而产生的一种淋巴因子。人辅助性T细胞受PHA(植物血凝素)或抗原刺激,鼠辅助性T细胞受ConA(刀豆蛋白A)或抗原刺激均可产生IL-2。人的IL-2产生细胞有末梢血淋巴细胞、脾细胞、扁体细胞、骨髓细胞和人白血病来源的传代的jurkat细胞系,鼠脾细胞、胸腺细胞和传代的鼠EL4细胞系,以及猿的MLAl44细胞系均可产生IL-2。

2.IL-2的生物学作用

IL-2的生物学作用是以刺激T细胞增生为主,故又称T细胞生长因子,除此之外还有其他重要功能。

(1)促T细胞增殖 当T细胞受到丝裂原或抗原刺激后,表面出现IL-2受体并与IL-2发生特异结合,结合后便启动IL-2受体阳性细胞大量繁殖。受体必须在抗原等刺激后,才能在辅助性T细胞表面表达,相反,静止的辅助T细胞(也就是未受到抗原刺激的)表面不存在IL-2的受体。

T细胞的激活与增殖分为三个时期:开始是细胞在丝裂原或抗原刺激下产生IL-2和其受体表达;然后进入IL-2依赖期,也就是IL-2与IL-2受体发生特异性结合和相互作用;三期表现为T细胞被激活,进入稳定的、不受外界环境影响的也不依赖IL-2存在的增殖期。IL-2不仅对辅助性T细胞有增殖作用,对抑制性T细胞也有同样作用。在体外IL-2作用下增殖的T细胞,仍具有原来体内T细胞的同样功能,为进一步研究 T细胞克隆、功能结构和治疗肿瘤提供了先决条件。

(2)对自然杀伤细胞(NK)的作用 NK细胞在机体内是一种极为主要的杀伤细胞,具有很强的清除肿瘤细胞和被感染细胞的功能。整个NK细胞的活化、分化和增殖均离不开IL-2,只有存在一定生理量的IL-2和干扰素,才能调节NK细胞保持它的自然杀伤活性。NK细胞是非胸腺依赖性和非MHC限制性的,在一定条件下(如受丝裂原刺激)还能产生IL-2、干扰素、白介素-1、肿瘤坏死因子、集落刺激因子等多种细胞因子。所以,IL-2在NK细胞发挥免疫调节、抗肿瘤等功能上具有重要作用。

(3)诱导细胞毒性T淋巴细胞产生和增殖 IL-2是抗原激活的细胞毒性T细胞前体细胞转化为细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的主要因子,只有IL-2存在条件下,CTL的扩增数量和杀伤肿瘤细胞活性才能明显增强。而CTL在IL-2存在时繁殖非常迅速,特异地杀伤肿瘤细胞,特异地识别肿瘤相应抗原,也是肿瘤浸润淋巴细胞的主要细胞群,Rosenberg已经证明肿瘤浸润淋巴细胞杀肿瘤细胞链应高于一般LAK细胞杀瘤细胞效应50~100倍。

(4)诱导淋巴因子活化淋巴细胞  在一定量IL-2存在下,淋巴细胞可转化成不仅能杀伤自身新鲜肿瘤细胞,而且也能杀伤同种异体瘤细胞,还能杀伤对NK细胞敏感和不敏感的瘤细胞,Rosenberg称此种淋巴细胞为淋巴因子活化的杀伤细胞(LAK)。IL-2可以在体外长期维持LAK细胞的增殖,在体内也具同样功能。LAK细胞能溶解肿瘤细胞主要依靠溶细胞素(cytolysin),而且LAK细胞杀伤肿瘤细胞不受MHC限制,具有广谱杀肿瘤细胞的活性,因此,建立了恶性肿瘤过继免疫疗法(AlT)。

(5)促B细胞增殖分化作用 IL-2能直接和间接(通过BCGF)促B细胞分化增殖,其直接作用说明IL-2具有BCGF的作用,所以,IL-2可以使B细胞分化成熟为能够产生免疫球蛋白的活化细胞。

(6)IL-2与其他白细胞介素等协同作用 IL-2可以和IL-1、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、肿瘤坏死因子、克隆刺激因子等有协同作用,由于IL-2可以使NK细胞增殖、则γ-干扰素产生也随之增加。IL2在细胞因子作用网络中起核心调节作用。相反,TGF-β对IL-2的促细胞增殖起拮抗作用。所以,今后对IL-2与各种细胞素的正负调节作用研究,将对免疫学基本理论发展和肿瘤治疗学发展起着重要作用。

b.  白细胞介素-2的临床应用

IL-2是机体免疫调节网络中的核心物质,与其他细胞因子有协同和拮抗作用,共同完成机体免疫机能的平衡调节作用;能刺激NK细胞、CTL、LAK细胞的活化和增殖,也能促使T淋巴细胞、NK细胞产生干扰素、肿瘤坏死因子等。所以,在抗病毒、抗细菌感染和抗肿瘤等疾病治疗中开始大量应用。基因工程IL-2的问世给临床治疗创立了先决条件。

1.抗病毒感染

在实验室中已经证明,IL-2对小鼠和豚鼠的HSV感染有明显的抑制作用。在慢性型活动型乙型肝炎病人的治疗中,也已显示出明显效果。慢性活动型乙型肝炎病毒感染后,免疫功能失调的病人即转为迁延型。然而,IL-2确能增强体内的NK、CTL、LAK等杀伤细胞活性,清除被病毒感染的肝细胞。诱生的INF-γ和TNF对病毒再侵入健康肝细胞加以抑制,IL-2对肝细胞起着清理污染的洁化作用。所以国外有人采用IL-2治疗慢性活动型乙型肝炎病人,每天静脉滴注250~1000U,经21d治疗后,发现患者淋巴细胞,特别是CD4+细胞明显增加,NK细胞杀伤活性明显增强,治疗的患者开始有SGPT增高,说明细胞免疫功能增强,破坏受感染肝细胞,这是IL-2效应象征。治疗后的患者中,一部分的HBeAg和HBsAg消失,HBeAg抗体和HBsAg抗体出现。

  2.抗细菌感染

    IL-2可治疗分枝杆菌引起的慢性感染,如麻疯病、慢性肺结核等。因为这些病人的表现为细胞免疫功能低下的特征,而IL-2能提高机体清除细胞的能力,所以上述病种也是IL-2治疗的适应证。

  3.抗寄生虫的感染

    IL-2能够增强疟原虫感染的患者T细胞对疟原虫抗原刺激的反应,而T细胞可大量增殖,细胞免疫功能也就增强。

  4.艾滋病的治疗

  获得性免疫缺陷综合征(AIDS)系受HIV感染,而CD4+细胞遭大量破坏所致。所以IL-2的产生、IL-2受体表达、INFγ产生都明显降低。而注射IL-2后,上述数种细胞数及活性均明显增高。所以用IL-2治疗艾滋病能够显示出一定效果,能增加患者抗肿瘤和抗其他病毒感染能力,可以改善机能状态。

5.IL-2佐剂作用

  国外学者证明,对接种乙型肝炎疫苗无抗体产生反应的小儿,再接种8000U的IL-2,过几天后再接种乙型肝炎疫苗,则抗HBsAg很快出现阳性,说明IL-2是很强的免疫佐剂。

  6.抗高血压作用

    有资料报道,高血压大白鼠,注射IL-2 5000U/kg体重,大白鼠高血压消失,一年之内不再表现高血压症状,但必须是机能性高血压,对心血管病理改变者的高血压无效,这也说明高血压病是免疫功能失调所致。

  7.抗肿瘤治疗

在恶性肿瘤的发病机制中,非常关键的是机体免疫功能失调和免疫监视功能低下的问题,这是随着近年来免疫学的发展而逐渐被人们所公认的事实。由于免疫监视功能低下,表现出细胞免疫功能低下,肿瘤病人体内的NK、CTL、LAK等杀伤细胞功能低下,就不能正常地清除肿瘤细胞。而这些杀伤性细胞的活化和增殖,均是以IL-2为基础的。

用IL-2培养的TIL做转基因治疗

做转基因治疗时,选用对肿瘤组织亲和性较强,而且又在IL-2培养液中能够很好繁殖的TIL。如何将细胞因子的基因转入TIL细胞内是一重要问题,Rosenberg采用从鼠类白血病病毒的变异株N2筛选出的逆转录病毒载体LNL6。该株编的码病毒核心蛋白、病毒逆转录酶和病毒包膜蛋白基因都已缺失或截短,所以具有明显的复制缺陷。同时其序列与人类逆转录病毒序列无同源性,排除了与之重组交换而引起病毒复制的可能性,LNL6的gag(编码病毒核心蛋白基因)的开放阅读框架发生了突变,使之不能产生任何的病毒蛋白质。

Rosenberg用LNL6载体插入一个细菌的新霉素抗性基因,将携有重组基因的逆转录病毒载体LNL6与逆转录病毒包装细胞PA317共同培养,分离出一株含有LN乙高滴度的克隆PA317/LNL6-C8。然后将此克隆放人Eagle’s培养液中生长,制成含病毒颗粒的上清液。上清液要做无菌试验、MAP检测、淋巴脉络丛脑膜炎病毒检测等,然后再做小鼠安全试验。

Rosenberg用5例晚期转移性黑色素瘤患者的自身瘤组织,在剪碎、酶消化等措施后制得的单细胞悬液,经聚蔗糖泛影葡胺液梯度离心分得TIL。将TIL移人含IL-2(1000U/m1)的培养基中培养扩增,残存肿瘤细胞全被杀死。当TIL总数达1.2×108~7.6×108时,移出1/3一1/2做转导实验,与LNL6的上清液共同培养,制成转导的TIL,剩余部分为未转导的TIL。对转导的TIL可做安全性检查,首先要确定是否有辅助病毒、4070A外膜基因和逆转录酶,然后用鲎分析检测该转录过程细胞是否产生内毒素,再检测LNL6载体所载外源基因,如新霉素抗性基因和表达产物是否存在(如此处插人TNF等基因,也需检测TNF等基因及表达产物),然后将该种细胞放在含有IL-2的培养基中培养扩增和观察细胞变化,以排除因随机整合作用而诱发的癌基因的激活。

每位患者分别接受2次细胞输液,每次输入量为2×1011个细胞,每隔8h注人IL-272万U/kg。Rosenberg要确定外源载体LNL6在体内的安全性,测定与LNL6有关项目,确定新霉素抗性基因的存在和体内是否存在有复制能力的逆转录病毒,也检测是否存在与gag抗原(病毒核心蛋白)作用的抗体。

经X线和CT扫描的检查,治疗6天到两个月后,3名患者肿瘤受到抑制,并出现消退,转导的TIL在体内至少活存3周,有两个人的TIL在体内存活可达两个月,所有病人都未见有因输入转导的TIL而引起的副作用,证明此法是安全的。

Rosenberg的工作,取得很满意的结果。实验证明具有复制缺陷的逆转录病毒作为载体,将一个外源基因(如TNF基因、干扰素基因和IL-2基因等)转人人体细胞中,治疗人类疾病是安全和可靠的。

B.重组人白细胞介素-2

重组人白细胞介素-2(humanrecombinant interleukin-2)是目前批准上市的两种白细胞介素-2之一。

1.简称

rHuIL-2。

2.结构与性质

本品是一种糖蛋白,由133个氨基酸残基组成的单链多肽,内含一个二硫键,由于几乎含有等量的酸性氨基酸和碱性氨基酸,故其等电点在pI7左右。结构中有3个半胱氨酸(Cys),Cys58与Cysl05之间形成二硫键维持本品的空间构象稳定,这是保持活性所必需的,Cysl25的存在易形成二硫键错配,形成二聚体,降低本晶的活性。!由此可见三个Cys在维护生物学活性中起重要的作用。

本品分子量为15000~17000,活性集中在N-端,除去N-端1~10个氨基酸残基活性降低30%~50%,除去N-端1~20个氨基酸残基使其活性完全丧失。本品对热不稳定,在65℃中仅保温30min后其生物学活性基本丧失。若加入1%SDS加热至70℃保持15min活性不受影响,故SDS可作为本品的稳定剂。本品对各种蛋白酶敏感,对核酸酶不敏感。在pH2~9的溶液中稳定。并具有明显的疏水性,这些性质均有利于纯化。

3.临床应用

本品的主要作用是激活免疫效应细胞和产生协同效应因子,共同有效地清除肿瘤细胞和病毒或细菌感染细胞,起到治病防病作用。具体作用是:①激活LAK细胞,清除病毒、细菌感染细胞,因而可以治疗病毒性肝炎、分枝杆菌和真菌的胞内感染等;②激活NK细胞,使它们变成LAK细胞,用这种过继性免疫疗法治疗肿瘤,对黑色素瘤、肾细胞癌疗效明显,对白血病也有一定疗效;③恢复T细胞功能,治疗免疫功能低下所引起的疾病或免疫缺陷所引起的疾病。这些作用都充分显示了临床应用的良好前景。

临床使用剂量根据不同病种而异,一般抗感染和免疫调节适用小剂量,即1万U~5万U,每日或隔日一针,肌肉注射。肿瘤治疗可用2万U~10万U以上,静脉注射。但用量大毒副反应也大,有时病人难以承受,所以若小剂量能达到治疗目的,尽量使用小剂量。应用小剂量在体外诱导LAK细胞,然后再回输给病人来达到治疗肿瘤的目的,效果比较满意,但此法技术难度较大,有待进一步改进。

4.不良反应

近年来,随着临床的广泛应用,rHuIL-2的毒副反应也逐渐引起人们的注意,成为限制其临床应用的重要原因,其常见不良反应有:

(1)心血管系统  rHuIL-2对心血管系统的影响较严重,常见有血压降低和心动过速,以及心律失常、心肌缺血、心功能抑制、心肌损伤等。Gaynor等测定了大剂量应用rHuIL-2(3×55U/kg·d)治疗36h后和血管加压支持开始前的几种血流动力学参数的平均值,结果发现:平均动脉压(MAP)从12.2kPa降至9.9kPa;血管阻力(SVR)从2.00kPa/(L·min)降至1.13kPa/(L·min);心指数(CI)从3.1L/(min·m2)升至4.7L/(min·m2);肺契压未变。rHuIL-2治疗对左室功能有抑制作用,可使射血分数降低10%~30%。在无冠心病的患者中,可看到肌酸酐酶的升高和心电图T波的改变。心肌缺血和梗死可能由低血压所引发。在rHulL-2治疗期间,非感染性心肌炎的发病率增高,且多以淋巴细胞浸润为特征。亦见rHulL-2治疗期间心钠素升高的报道。

(2)呼吸系统  Rosenberg等报道在rHuIL-2疗程中,有19%的患者发生水肿,其中16例需气管插管。另一项研究表明,19例患者在大剂量rHuIL-2治疗前5天内,分别有21%、23%、54%发生肺泡水肿、间质性肺水肿和胸腔积液。Villani等对12例黑色素瘤患者rHuIL-2治疗前后的肺功能指数做了测定,结果在第直疗程(400μg/m2,每日3次,连续4d)后,其肺总量(TLC)、肺活量(VC)、残气量(RV)、1秒量 (FEVl)、最大呼气中期流速(FEF25~75)、1秒率(FEVl/FVC)、一氧化碳弥散(TLOD)和一氧化碳弥散并泡通气量(TLCO/VA)均较治疗前显著降低(P<0.05)。第2疗程后Pa02显著降低而PaCO2则显著升高,呼吸频率显著增加,X线胸片示几乎所有患者均有不同程度的肺水肿,6例因呼吸困难而需吸氧。

(3)消化系统  Rosenberg等报道在用大剂量rHuIL-2治疗期间,大约85%的患者有胃肠不适、食欲不振、恶心、呕吐、腹泻等症状,严重者可致结肠局部坏死或穿孔。亦有腹胀、腹水、胆红素及转氨酶升高的报道。

(4)血液系统  Michie等报道11例癌症患者,用药前肝、肾功能及血细胞计数均正常,静脉输注rHuIL-2 30000U/kg后,血白细胞计数先是轻度下降,随后持续上升。单核细胞先是迅速下降,随后逐渐上升,6h后接近用药前水平。淋巴细胞则表现为持续下降。中性粒细胞在用药2h后持续上升,4h后达稳定水平,约为用药前的2倍。红细胞及血小板下降在rHuIL-2治疗过程中也常见。Klempner等测定了31例癌症患者rHuIL-2用药前后的中性粒细胞过氧化物、噬中性颗粒形成分泌、吞噬作用、杀菌力和趋化性,结果在治疗前31例患者中性粒细胞测定的各项功能均正常,rHuIL-2治疗后,患者中性粒细胞对甲酰肽的趋化性反应受到严重损伤,对酵母多糖活性血清的趋化性反应也异常,但中性粒细胞的其他功能则正常。

(5)泌尿系统  常见有体液潴留、氮质血症、尿量减少等。Belldegrun等报道用rHuIL-或rHuIL-2加LAK细胞治疗的癌症患者,90%有不同程度的肾功能障碍。表现为血肌酐浓度升高、体重增加、少尿、尿钠排出下降、高尿酸血症。但治疗结束后,这些症状可逐步恢复。但患者如原有肾功能异常时,则在rHuIL-2治疗过程中肾功能障碍加重,且恢复时间也长。

(6)神经系统  Fenner等报道在625例接受rHuIL-2治疗的患者中,33%发生定向力障碍,5%有明显的昏迷症状。44例大剂量静注rHuIL-2的患者,22例有严重的认知改变、频繁的焦虑不安、幻觉或明显的幻觉综合征。另可见轻度感觉障碍、暂时性肌无力及轻度偏瘫。核磁共振表明,rHuIL-2治疗后脑中水的成分可增加,可引起血管漏出综合征。Denicoff等通过分析rHuIL-2对神经内分泌、脑电及行为的影响,认为rHuIL-2可聚集行为激动因子,改变血脑屏障通透性,加强行为激动因子对CNS的作用,直接或间接地影响CNS,从而导致精神症状。

(7)内分泌及代谢等系统 Michie等报道给予rHuIL-2后,血中儿茶酚胺首先升高,促肾上腺皮质激素、可的松、肾上腺素、去甲肾上腺素、肾素分泌均升高。Atkins等观察到rHuIL-2与LAK细胞合用时,可使甲状腺素分泌减退,从而导致内分泌功能的紊乱。RHulL-2治疗期间的代谢变化主要是发热、寒颤及全身不适等。以及血钙、血磷、血浆白蛋白降低,大剂量rHulL-2与LAK细胞合用出现严重维生素C缺乏。

(8)皮肤反应 Gaspari等报道rHuIL-2治疗2~3天后,多数患者出现皮肤红斑,伴有发热和瘙痒。一般局限于头颈部,有时也可遍及全身。停药后48~72h可消退,并伴有局部脱皮、皮肤多发性溃疡、脱发、银屑病复发等。

对rHulL-2不良反应,多数认为与血管漏出综合征(VLS)有关。VLS是指毛细血管内皮细胞通透性增加,部分血液成分外漏至组织间隙而引起的一系列病理生理变化,如体液潴留、肺间质水肿、血压降低、少尿等。Rosenstein等通过大剂量静注rHuIL-2观察小鼠VLS,发现白蛋白持续向组织渗出与rHuIL-2的给药剂量及给药时间直接相关。但预先给予环磷酰胺或放疗后,可部分阻止VLS的出现,而且在无胸腺的裸鼠体内则不引起VLS。表明rHuIL-2并不直接引起VLS,很可能是T淋巴细胞及它们的间接产物所致。

C.新型人白细胞介素-2

新型人白细胞介素-2(125Serhuman recombinant interleukin-2)是目前批准上市的另一种基因工程白细胞介素类药物。

1.简称

125Ser rHuIL-2。

2.商品名

Proleukin。

3.结构与性质

本品结构与天然的IL-2不同之处是将125位的Cys,通过点突变的方法改为丝氨酸(Ser)。这样的新型IL-2性质有所改变,即因不易形成二聚体,比活性提高;对热较稳定,在65℃加热30min,活力仍保持20%左右,失活后恢复活性较快,加热失活后放置在0.1%SDS溶液中,10min后能恢复原来活性的80%~90%。同时在体内的半衰期也延长了。这些性质的改变均有利于纯化和临床应用。

4.临床应用

本品是改型的rHuIL-2,优点是提高了活性和延长了在体内的半衰期,这样可减少注射剂量,降低毒副反应。但因与天然IL-2结构不同,改变了一个氨基酸,多次注射后更易产生抗体,一旦产生抗体,不但药效损失,还有可能引起过敏反应。因此长期使用本品时,应定期测定抗体。

本品的临床作用与天然IL-2是一样的,可提高人体对病毒、细菌、真菌、原虫等感染的免疫应答,使细胞毒性T细胞、自然杀伤细胞和LAK细胞增殖,进而清除体内肿瘤细胞和病毒感染细胞等。还可增进抗体和干扰素的分泌,它是机体免疫应答核心物质之一,是一种免疫增强剂,具有抗病毒、抗肿瘤和增强机体免疫功能等作用。

本品临床应用的病种有:①肿瘤:对癌性胸、腹水的控制和消除效果显著。一般局部注射2万U~10万U,持续至胸、腹水消失。可试用于肾癌、肺癌、肝癌、胃癌、膀胱癌伴有的胸、腹水治疗;②抗感染:某些病毒性、细菌性和胞内寄生菌感染性疾病,如乙型肝炎、麻风、结核等,肌肉注射本晶2万U~5万U,每日或隔日一次,特别对麻风的治疗作用显著;③免疫调节:手术、化疗及放疗后,本品可加速机体免疫功能的恢复。本品对于先天和后天免疫缺陷症的治疗也有一定疗效。肌内注射2万U~5万U,可隔日注射一次。本晶的副作用同天然IL-2。但因用量稍低于天然IL-2,故毒副反应亦较低,产生抗体的比例要比天然IL-2高得多。

5.规格

同rHuIL-2。

6.贮藏

同rHuIL-2。

(三)集落刺激因子

集落刺激因子(colony—stimulatingfactor,CSF),是一类能参与造血调节过程的糖蛋白分子,又称造血刺激因子或造血调节因子。早在几十年前已知促红细胞生成素与红细胞生长有关,但直到20世纪60年代后期体外造血细胞培养技术获得成功后,Bradley等才首次从造血细胞培养中,发现骨髓细胞要分化增殖为粒—巨噬细胞集落,还需要有一种刺激造血的物质参与,此物质即称为集落刺激因子。我们知道造血系统的能力在机体内能保持终身供应成熟细胞和对刺激发生反应,扩大已知细胞类型的数目。机体能够保持这种能力,提示一定存在一种调节每个细胞系中细胞的增殖和分化的机制。已知在体内造血是微环境中短期调节剂以及血循环中长期调节剂同细胞的相互反应的结果。在体外所有非淋巴样造血细胞可以受一组具有独特或交叉特异性,来自不同细胞系的集落刺激因子所刺激。

造血因子是由几种细胞类型合成的,它们之中一些广泛分布在造血和非造血的组织中。这些生产造血因子的细胞是应用了单克隆细胞系来证实的。用免疫活化的淋巴样细胞的体外研究首先证实了T淋巴细胞能够合成其中某些因子,以后从来自不同的T细胞淋巴瘤,杂交瘤和依赖IL-2的细胞系和克隆的证据,表明了其他类型的细胞不存在时它们也产生各种集落刺激因子。用某些单克隆细胞群体作的研究表明单一的细胞克隆,能够产生几种不同的,但具有明显相等形式的细胞因子,包括CSFs、IL-2、B细胞刺激因子和γ干扰素。现在已知CSF的种类有:粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF),粒细胞集落刺激因子(G-CSF),巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF),多潜能集落刺激因子(Multi-CSF)还有类似CSF活性的促红细胞生成素(EPO)等。

A.集落刺激因子的分类

根据集落刺激因子刺激骨髓细胞所形成克隆的细胞类型特点,可将它们分为两大类:一类因子作用于造血干细胞,它们是多能集落刺激因子(multi-CSF,IL3),粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。一类因子作用于更为成熟的造血祖细胞及其分化的特殊系列的细胞,它们是巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF),粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。

近年来的研究表明,集落刺激因子不仅在造血细胞的增殖与分化中起重要作用,而且也参与对成熟细胞的功能调节,并在宿主抗感染免疫中起着重要作用。

a.粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)

GM-CSF是最早被描述、纯化并克隆的造血生长因子之一。其主要来源为T淋巴细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞、内皮细胞和纤维母细胞。分子量为14000~35000,基因定位在染色体5q。人GM-CSF基因有四个外显子和三个内含子。GM-CSF有广泛的特异性作用,除能刺激半固体培养基中骨髓祖细胞增殖、分化形成粒细胞和巨噬细胞集落外,还能刺激嗜酸性粒细胞和巨噬细胞及早幼红细胞和多潜能祖细胞的初期增殖。此外还发现GM-CSF除对成熟造血细胞的产生有作用,还能明显增强成熟细胞对细菌和寄生虫感染的反应能力。现已证明中性粒细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞表面具有GM-CSF特异性受体。所以有学者认为CSF是通过与靶细胞上相关受体的结合而发挥其生物效应。

GM-CSF是CSF中最重要的一种因子。有二项功能,即:①使造血祖细胞能在体外克隆繁殖并形成集落;②对有两种发育倾向的GM祖细胞在其作用下经过1~2次细胞分裂而朝一种分化途径定向,但对其在体内的功能还缺乏明确的实验结果。现在由于有了重组的GM-CSF,对以下两点有较清楚概念:①GM—CSF具有红细胞抽芽促进活性。同时, GM—CSF也刺激来自多坦细胞的集落形成。最近在人类膀胱肉瘤细胞株中提纯出一种CSF,在理化性质上与GM-CSF十分相似。如果能从一级结构上提供更明确的信息,则GM-CSF在多能干细胞的存活与分化上的作用将更明确。②GM-CSF也能抑制嗜中性粒细菌的转移,能使细菌性促趋化剂N-甲酰甲硫氨酸—亮氨胱苯丙氨酸(f-MLP)促进超氧离子产生的能力提高4倍。这说明GM-CSF是一种中性粒细胞的活化因子,此外,GM-CSF与一种由T淋巴细胞中提纯得到的嗜中性粒细胞转移因子(NIF-T)具有相同的分子量22000,和相同的N末端。这提示GM-CSF与NIF-T很可能就是同一种因子。

GM-CSF是有种属特异性的,现在电于重组GM-CSF得到成功,使得GM-CSF已从一种实验研究的对象成为一种临床应用的制剂,就有可能用于治疗人的造血障碍、免疫缺陷、炎症反应及肿瘤等方面。

b. 粒细胞集落刺激因子(G-CSF)

G-CSF主要来源于巨噬细胞、内皮细胞及纤维母细胞。能高度特异性地刺激中性白细胞系的前体细胞存活、增殖和分化,同时也是成熟的中性白细胞的功能活性因子,包括对细菌反应的能力、吞噬功能以及通过ADCC杀伤肿瘤细胞。

G-CSF是糖蛋白,它的分子量是19600。基因定位在染色体17。它的基因含有5个外显子和4个内含子。已分离出2个cDNA,分别编码177个氨基酸的蛋白质和174个氨基酸的蛋白质。后者缺失第36、37、38个氨基酸。分析表明两种形式的G-CSF都有生物活性,但作用上可能有所差别。人和鼠的G-CSF的生物活性和受体结合性有种属交叉反应。G-CSF在维持体内中性白细胞水平和活性上起重要作用。

高度精制纯化的G-CSF同含有N—末端甲硫氨酸而不是O-糖苷化的天然CSF是不一样的,用鲎试剂来检测rhG-CSF,以保证从体内试验中所得到的生物学反应并不是由于内毒素污染制品而引起的,精制的rhG-CSF在0.5mg/ml浓度时,内毒素含量小于500pg/ml。对急性白血病患者化疗后用rhG-CSF治疗,有效地缩短了中性白细胞的恢复时间。

G-CSF和GM-CSF的异同点:由于G-CSF和GM-CSF在许多相关的临床病例中可能有用,所以它们之间生物学特性差异,对某些疾病发病机理的认识有一定的意义。

(1)G-CSF特异性刺激中性白细胞,而GM-CSF则是所有粒细胞的总刺激因子。例如若要通过提高嗜酸性效应细胞水平来治疗寄生虫感染,则GM-CSF作用比G-CSF为好。

(2)GM-CSF是单核细胞和巨噬细胞的强激活剂,而G-CSF则不是。这种激活包括诱导产生诸如肿瘤坏死因子和IL-1一类的其他细胞因子。如需要提高单核细胞和巨噬细胞活性,可选用GM-CSF,而不是G-CSF。

(3)GM-CSF是中性白细胞移动的强抑制剂,然而G-CSF则增强中性白细胞的移动。例如当局部损伤时,GM-CSF可在局部产生,起弱的化学诱导剂作用,抑制炎症细胞离开炎症部位,而G-CSF则能增强炎症细胞向炎症部位移动。这可能是两种造血生长因子共同提高宿主防御力的一种途径。在细菌性脓毒症时,接触内毒素可刺激单核细胞、巨噬细胞产生G-CSF,然后G-CSF刺激骨髓产生和释放中性白细胞,同时受刺激的巨噬细胞产生IL-1,而IL-1刺激T细胞产生GM-CSF和IL-3,以增加骨髓内的骨髓细胞生成和进一步增强白细胞应答。

c. 巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)

巨噬细胞、纤维母细胞、单核细胞等多种细胞均可产生M-CSF,其受体主要表达在中性粒细胞和巨噬细胞上。它能增强巨噬细胞的细胞毒性,是CSF中唯一没有种间特异性的CSF。M-CSF的分子量为45000~90000,基因定位于染色体5。已知的靶细胞为单核细胞和巨噬细胞。

单拷贝的M-CSF基因长约21×103,具有10个外显子,9个内含子。mRNA水平的基因表达是不均一的,mRNA编码二种不同的M-CSF蛋白,分别为256个氨基酸和544个氨基酸,M-CSF的初级转录产物是一种前多肽。加工既发生在氨基末端,也发生在羧基末端。但从C末端的缺失突变显示,仅仅其中150个氨基酸即具有活性。尽管这种蛋白庐是高度糖基化的,但移去与N端相连的糖基化部分,似乎并不影响生物活性。

d. 多潜能集落刺激因子(Multi-CSF)

又称为白细胞介素-3(IL-3)。Multi-CSF的分子量为14000~28000,基因定位在染色体5。它是由活化的T淋巴细胞产生的。其作用的靶细胞更为原始,能作用于一些具有自我更新能力的多能造血干细胞和祖细胞。在Multi-CSF的激发下产生中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性细胞、嗜碱性细胞及巨核细胞。其受体同时在嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞及单核细胞上表达,但在成熟中性粒细胞上则不存在。试验证明IL-3对血细胞数目的影响直接与其对祖细胞功能影响有关。

以上四种集落刺激因子及其作用的靶细胞和分子量列于表3-10。

表3-10  人类集落刺激因子

种 类

作用的靶细胞

分子量(×1000)

GM-CSF

单核巨噬细胞、中性酸性粒细胞、多能祖细胞、红细胞

14~25

G-CSF

单核巨噬细胞、中性粒细胞

18~22

Multi-CSF(IL-3)

巨核细胞、巨噬细胞

14~28

M-CSF

单核巨噬细胞

45~90(双聚体)

B.集落刺激因子的临床应用

集落刺激因子的临床应用主要包括以下几个方面

(1)细胞因子的免疫调节作用。

(2)癌症病人的治疗。

(3)AIDS病患者的治疗。

(4)骨髓衰竭状态病人的治疗。

(5)骨髓移植。

(6)治疗骨髓发育不良。

(7)其他疾病:如治疗先天性、特发性及周期性白细胞减少;治疗患白血病、恶性淋巴瘤导致白细胞减少并发真菌感染的病人等。

a. 重组人粒细胞集落刺激因子

英文名称为recombinant human granulocyte colonystimulating factor

1.简称

rHuG-CSF。

2.商品名

惠尔血、优保津、诺以托罗津、Filgratim、GRAM、Neupogen、NEUTROGIN。

3.临床应用

在细胞培养液中加入G-CSF引起一系列生物功能变化,这些变化不宜完全直接类推于活体,是因机体内复杂环境所致,如G-CSF与其他细胞因子及内源性G-CFS之间的相互作用等。因此其生物效应体现在:

(1)对造血前体细胞的作用  G-CSF可延长中性粒细胞系各个阶段的祖细胞在体内外的存活时间,加速多能干细胞进入细胞周期,刺激其增殖,并且还有诱导分化的作用。不仅诱导正常粒细胞系的分化,还可诱导单核、巨噬细胞的形成及白血病和某些非白血病细胞株的分化。

(2)对成熟中性白细胞的作用  在感染时产生的内源性G-CSF一方面可诱导骨髓产生更多的中性粒细胞,另一方面可促进中性粒细胞向炎症部位移动,并促其对细菌和真菌,的调理作用及吞噬功能,加强其抗体依赖性细胞毒介导的细胞毒作用(antibody-depen-dent cell-mediatedcytotoxicity,ADCC)以及加快有关的细胞代谢。

(3)对肿瘤细胞的作用  G-CSF能加强中性白细胞对肿瘤细胞的ADCC作用,此作用与G-CSF能诱导出高亲和力IgG受体有关。G-CSF还对血液系统肿瘤细胞具有诱导分化作用,如碱性磷酸(NAP)为中性白细胞成熟与否的标志,而NAP活性降低为慢性髓性白血病(CML)的重要特征之一,G-CSF与CML患者血标本共同培养后显示出 NAP积分增高。G-CSF不仅能诱导CML病人的恶性细胞分化,还能参与诱导白血病 HL-60细胞的分化及急性髓系白血病(AML)母细胞的成熟。

其在临床治疗方面的应用主要包括:

(1)配合抗生素治疗严重感染性疾病  实验表明,在注入致死量的金黄色葡萄球菌或绿脓假单胞菌后给予G-CSF,可使小鼠存活期较对照明显延长;且对单用抗生素无效或效果不佳者加用G-CSF可提高疗效。此外,在新生小鼠B型链球菌败血症,用G-CSF加抗生素治疗也取得良好效果。总之G-CSF能为机体提供快速及有效的抗感染体系,特别是危及生命的严重感染。

(2)肿瘤化疗所致白细胞减少症  恶性肿瘤、白血病患者在化疗后常出现免疫机能受损,特别是引起骨髓抑制,因而反复遭受各种感染。而此时单用抗生素收效不佳,主要原因是他们体内的中性粒细胞(介导机体早期防御机制的重要细胞)功能和数量异常。研究资料表明,结合化疗应用G-CSF可刺激大量产生及释放正常功能的中性粒细胞,加快粒细胞的恢复,使化疗所致粒细胞减少及粒细胞减少性发热的发生率降低50%,并且减轻其程度,从而减轻或减少感染,减少抗生素的应用,提高病人对化疗的耐受性。

(3)在骨髓移植(BMT)和外周血干细胞移植中的应用 在自体或异体BMT后应用 G-CSF,可以加速中性粒细胞降低症的恢复,最终降低致死率。用G-CSF活化后的干细胞进行自体周围血干细胞移植作为BMT的替代或补充,在多发性骨髓瘤、恶性淋巴瘤等的治疗中取得良好效果,且越来越受到重视。

(4)慢性粒细胞减少症  用于骨髓增生异常综合征(MDS)、再生障碍性贫血(AA)、慢性周期性粒细胞减少症以及艾滋病、放射损伤等所致粒细胞减少,其治疗目的在于将粒细胞的数量和功能提高或维持于能预防和对抗感染的水平。体内试验表明,注射rhG-CSF后外周血白细胞总数、中性粒细胞绝对计数明显提高,且与rhG-CSF剂量成正比,淋巴细胞(主要是T细胞)数也升高。骨髓细胞增生以粒系为主,可增加5~10倍,并出现髓外造血灶。

(5)白血病的诱导治疗  G-CSF对某些人体系白血病细胞株有明显抑制诱导分化作用,可使白血病干细胞的增加受抑制,并产生不具分裂能力的成熟子细胞。故临床上已将G-CSF用于治疗白血病,应用几年尚未见严重副反应的报道。

4.G-CSF水平测定在临床上的应用

由于G-CSF是能在于细胞、祖细胞和成熟细胞不同水平上促进中性粒细胞和单核细胞的生成和功能的重要调节因子,因此G-CSF水平的变化在某种意义上反映了机体造血、血细胞生长、分化、功能及免疫机能状况。在不同疾病或同一疾病的不同阶段,血清或组织液的G-CSF水平不同,故而检测G-CSF水平具有重要临床意义。

(1)G-CSF的正常值 G-CSF的基础水平很低,且各实验室检测的灵敏度不同,故目前尚无统一标准。用目前常用的ELISA方法所测得的健康成人最低值是10.9pg/ml,性别间无差异,G-CSF水平与白细胞或中性粒细胞绝对计数(ANC)无关。Shinxxh等测定59例正常足月新生儿出生时的G-CSF,结果10例为20~57pg/ml,其余<201pg/mi,随后又跟踪测定了其中16例的变化情况,其中5例无变化,11例在4.5~18hg G-CSF达峰值(26~364pg/m1)。

(2)G-CSF水平与感染性疾病 研究资料证实,细菌及其产物包括内毒素是刺激和 调节G-CSF产生的重要物质。将细菌或内毒素注入动物体内后血清G-CSF水平迅速上升,可较正常高出1000倍,同时组织合成G-CSF增加。这种现象发生在数分钟内,3~6h达高峰,病原微生物及其产物被清除后24~48h内G-CSF降至正常,从而使效应细胞的激活和增殖过程中止。还有实验表明实验动物血清G-CSF水平与其感染细菌的数量和细菌在体内繁殖的数量相关。因此,对于细菌性脑膜炎、胸腹腔感染患者,其脑脊液、胸腹水中G-CSF水平较血清G-CSF明显增高。由此可见G-CSF在机体感染病原微生物过程中不仅是重要的防御机制之一,也是表明病原微生物在体内繁殖与否的一个十分灵敏而准确的指标。由于病毒感染及其他非细菌感染性疾病所致发热病人,血清和组织液G-CSF水平无明显升高,故测定病人G-CSF水平可作为临床辅助诊断方法,对各类发热性疾病的诊断、鉴别诊断有一定意义,也为临床合理应用抗生素提供帮助。

(3)G-CSF水平与血液系统疾病 ①许多研究显示,再生障碍性贫血患者血清G- CSF升高,且与ANC呈负相关;也有部分AML、CML、ALL、CLL及MDS病人血清G-CSF升高。上述G-CSF水平上升是否为病原机制的一部分尚无定论;②各类粒细胞减-少症:研究表明,在自身免疫性细胞减少症和严重先天性粒细胞减少症(Kostmann综合征)以及婴儿慢性粒细胞减少症患者,血清G-CSF水平升高,特别在ANC<0.5×109/L时更为显著。此外周期性粒细胞减少症也发现G-CSF水平大幅度波动。故测定G-CSF水平有利于疾病的诊断,也可为揭示尚未明确的病理机制提供线索。

(4)G-CSF水平与骨髓移植 Hass等对48例自体BMT或自体血干细胞移植患者血 样本G-CSF水平进行测定,发现所有病人在骨髓抑制期均有G-CSF水平显著升高。平均峰值达2199pg/ml(453~8676pg/m1)。峰值出现时间平均为移植后第5天,与年龄、性别、诊断和移植方式等无显著相关,而G-CSF水平与白细胞计数呈负相关。Cairo等也报道自体、异体BMT患者G-CSF水平与ANC呈负相关,G-CSF在第5~10天达峰值(699±82.3)pg/ml,同时ANC渐升。而ANC上升至正常范围是移植成功的关键,故提示内源性G-CSF水平可作为BMT预后早期指标之一。

(5)其他:如前所述,rhG-CSF已应用于临床治疗,在治疗过程中动态观察G-CSF水平可指导药物剂量和疗程的调整,对疗效进行评价和观察。此外部分伴白细胞升高的非血液系统恶性肿瘤患者血清G-CSF水平升高,某些免疫性疾病患者也有G-CSF水-平异常等。因此G-CSF测定对临床诊断有帮助,对探讨疾病的发病机制也有价值。

(b)重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子

英文名称为recombinant human granulocyte macrophagecolnystimulating factor。

1.简称

rHuGM-CSF。

2.商品名

生白能、Leucomax。

3.药理学特性

GM-CSF是位于染色体5q21~23基因位点编码的非糖基化蛋白质,由127个氨基酸组成,其分子量为14370。单核细胞、活化T细胞、成纤维母细胞及内皮细胞均可合成。在体内作用方式为旁分泌,即在造血微环境中近距离地直接作用于靶细胞,其有效浓度仅1012mol/L。GM-CSF受体为一双链分子,其亚基有高亲和力和低亲和力之分。GM-CSF与其受体的α链结合后以激活单核细胞为主,与β链结合后则以调节成熟细胞功能为主。这两种受体结构在粒系、单核系及成熟细胞上以不同表达形式而启动这些细胞行使不同效应子的功能。外源性的GM-CSF也可通过这些受体起作用。RhGM-CSF具有天然GM-CSF相同的活性。体外实验结果表明,rhGM-CSF能刺激骨髓细胞形成CFU-G、CFU-M、CFU-GM,增加中性粒细胞、单核细胞、T淋巴细胞数量,促进巨噬细胞和淋巴细胞对肿瘤细胞的裂解作用,对B淋巴细胞作用不明显。rhGM-CSF的另一作用就是动员骨髓造血祖细胞进人外周血液。此外,还发现rhGM-CSF能激活体内成熟单核细胞,增强其杀菌和抗肿瘤能力。给药途径多为皮下注射,持续静脉滴注亦可。健康受试者皮下注射3—4h达血药峰值,清除tl2为2~3h,静脉注射t1/2为1~2h箱常用量为5~10μg/(kg·d),连续7~10d。不能与化疗药同时应用,化疗停药后24h方可应用rhGM-CSF,而rhGM-CSF停药后48h方可开始下一疗程化疗。

4.临床应用

rhGM-CSF现已大量应用于骨髓抑制所引起的中性粒细胞减少症,如常规化疗或大剂量放化疗预处理后接受骨髓移植病人的治疗,以减轻这些病人中性粒细胞减少的程度和持续时间,减少感染并发症的发生。

(1)肿瘤放化疗后中性粒细胞减少 抗肿瘤药物的骨髓毒性使化疗病人白细胞严重减少并导致致命的感染,迫使很多病人在化疗的关键时刻中断治疗,明显地影响了肿瘤病人的远期临床疗效。在化疗之间,rhGM-CSF可作为一种支持治疗来减轻化疗药物的毒性并加速骨髓增殖,增加外周血白细胞数,提高机体抗感染能力,以利化疗方案的实施甚至提高化疗药物的剂量,增加化疗的适应证。在小细胞肺癌、乳腺癌、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤等实体瘤病人化疗后24h开始皮下注射rhGM-CSF 5~10μg/(kg·d)者,中性粒细胞减少时间明显缩短,发热的发生率减少、持续时间缩短,感染的发生率减少、其严重程度减轻,抗生素用量减少,住院时间明显缩短。晚期口腔癌病人化疗后给予rhGM-CSF治疗者中性粒细胞<0.5×109/L的发生率21%,而对照病人为90%。小细胞肺癌病人化疗后给予rhGM-CSF治疗者白细胞最低值为2.3×109/L,对照病人为1.0×109/L,低于4.0×109/L的持续时间分别为5和10d,白细胞开始恢复的时间分别为12和18d。

(2)急性白血病(AML) AML病人应用rhGM-CSF可缩短化疗后中性粒细胞减少的持续时间并减少感染的发生率。化疗前应用可增加白血病细胞对化疗药物的敏感性。36例(高危HR0AML病人在诱导化疗后中性粒细胞减少的持续时间缩短6~9d(P=0.009—0.043),化疗后早期死亡从39%减少至14%(P=0.007)。体外实验发现rhGM-CSF与AML病人骨髓细胞保温48h后再加人3HAraC保温24h,3HAraC掺人量增至2.3倍。因此,rhGM-CSF可提高化疗药物的疗效。

(3)自身骨髓移植后造血恢复 因考虑到rhGM-CSF有加重移植物抗宿主病(GVHD)的可能,首先应用于自体骨髓移植(ABMT)病人,涉及的疾病有:HD、NHD、ALL、乳腺癌、黑色素瘤等。有关rhGM-CSF的I~Ⅱ期临床研究已有多组报道,普遍认为rhGM-CSF不能缩短移植后粒细胞缺乏期,但能显著加速中性粒细胞的恢复,rhGM-CSF 2~22μg/(kg·d)均有促进造血的作用,并呈剂量依赖性。由于rhGM-CSF毒副作用随给药剂量的增加而加重,Visani和Gorin等在进行rhGM-CSF的Ⅲ期临床研究中,给药剂量分别定为250μg/(m2·d)或10μg/(kg·d),移植后当天或第1天开始给药,当中性粒细胞数连续3d>1.0×109/L或连续7d>0.5×109/L时减量至停药,疗程不超过28d。结果表明:①rhGM-CSF明显促进移植后中性粒细胞的恢复,如Gorin等报道的88例非霍奇金淋巴瘤病人,治疗组41例的中性粒细胞>0.5×109/L所需时间的中位值从对照病人的21d提前至14d;②rhGM-CSF对血小板恢复无明显作用;③感染发生率明显减少,美国骨髓移植中心发现治疗组病人感染发生率较低,发生咽炎、粘膜炎的病人少,程度轻;④病人住院时间缩短,治疗组病人比对照组病人约提前5d出院。Nemunaitis等随访27例rhGM-CSF治疗病人,1年无病存活率(已活存155~982d)达10%以上,没有发现晚期移植失败的病例。

不是所有的病人对治疗均有反应,Blazar等观察了16例经4-HC、抗T或抗B淋巴细胞McAb体外净化的ABMT病人,只有5例对rhGM-CSF治疗有反应,相关因素分析表明,回输的骨髓CFU-GM量与机体对rhGM-CSF的反应有显著的相关性。而Rizzoli等应用rhGM-CSFl0μg/(kg·d)治疗13,例ABMT病人,其中9例病人骨髓回输前给予Asta-z-7557净化处理,净化后回输的骨髓CFU-GM量明显减少,但移植后粒系恢复同未净化组相比无明显差异,中性粒细胞>0.5×109/L所需时间分别为14.2和13.4乙可回输的CFU-GM不是影响造血恢复的内在因素。进一步研究发现机体对rhGM-CSF的反应同回输的CFI-blast量明显相关,由此提示rhGM-CSF在体内的作用不限于刺激CFU-GM向成熟中性粒细胞分化,有可能刺激较CFU-GM更为幼稚的祖细胞,如 CFU-blast的增殖和分化,而体内一定量早期造血祖细胞的存在是rhGM-CSF发挥作用的基础。在有效治疗剂量范围内60—250μg/(m2·d),rhGM-CSF毒副作用较轻,仅少数病人出现发热、骨痛或局部潮红,个别病人表现有关节水肿、浆膜腔积液,发病率随给药剂量的增加而升高,对症治疗或停药后,症状逐渐消失。

(4)异基因骨髓移植后造血恢复  同ABMT相比,异基因骨髓移植(allo-BMT)有两大特点:一是造血恢复慢,感染发生率高;二是移植后出现GVHR或GVHD。应用rhGM-CSF的目的在于促进移植后造血恢复,是否加重GVHD尚有争论。一派认为,rhGM-CSF在体内可激活宿主T细胞或增加TNF及IL-1的表达,加重GVHD或增加移植失败率;另一派则主张,因为移植后感染可加重GVHD,rhGM-CSF加速中性粒细胞恢复,减轻感染,将有利于改善GVHD。临床观察表明rhGM-CSF在不加重GVHD的情况下,能加速移植后病人中性粒细胞的恢复;长期随访未发现移植失败及复发率的增加。rhGM-CSF促进allo-BMT病人粒系造血恢复的疗效似乎不如ABMT病人明显。几组有关rhGM-CSF在allo-BMT中应用的报道,尽管病种不同(恶性血液病、再生障碍性贫血),移植条件有差异(HLA相合与不相合,去T与不去T),对照设计不统一(以往对照与随机对照),但在给药方案接近的情况下[250μg/(m2·d)或8μg/(kg·d)],结果却比较一致:治疗组病人移植后9d至14d中性粒细胞明显高于对照组,淋巴细胞、单核细胞及嗜酸性粒细胞恢复晚于中性粒细胞,均高于对照组;血小板恢复仍较缓慢,未见GVHD加重的报道,移植失败率无增加,毒副作用与ABMT相比无特殊。通过对allo-BMT病人的随机双研究发现治疗组病人血红蛋白、血小板明显低于对照组,血浆中肌酐、BUN及胆红素却比对照组高,分析可能与轻度溶血性尿毒症有关。

白血病复发是影响BMT远期临床疗效的主要原因之一,尽管rhGM-CSF在体外能扩增髓系白血病细胞,但尚未发现使移值后白血病复发率增高的报道,分析可能原因有:①放、化疗预处理后残存的白血病细胞受损或受抑制,在短期内缺乏对rhGM-CSF反应的能力;②体外实验发现rhGM-CSF对正常细胞的增殖作用明显高于白血病细胞。

(5)外周血干细胞动员  rhGM-CSF动员的外周血干细胞(PBSC)移植是其临床应用中一个有前景的研究方向。生理状态下,干细胞在外周血中含量极少,分离困难,不能满足移植的需要,因此常用环磷酰胺等药物动员PBSC,经过一段中性粒细胞缺乏期,干细胞在外周血中反跳性升高,此时可分离出较多的PBSC用于移殖。但因每次分离的PB-SC量不稳定,常与骨髓造血细胞联合移植;化疗后应用rhGM-CSF,不仅缩短了中性粒细胞缺乏期,减少了感染并发症;而且还使干细胞在外周血中反跳时间提前,幅度升高,通过较少次数的白细胞分离便可获得大量的PBSC,从而为单独PBSC移植提供了条件。此外,免疫荧光分析发现,在动员的PBSC中,CD34+HLA-DR-细胞含量增加,富集后体外液体培养,其增殖能力不亚于骨髓来源的细胞,也为PBSC移植提供了理论依据。Serke等对多发性骨髓瘤病人常规接受马法兰和泼尼松治疗后给予rhGM-CSF,病人外周血中CD34+细胞升至12.5倍。有报道应用AFM化疗方案对16例乳腺癌转移病人给予4个疗程诱导治疗,并对l、2疗程有反应的病人于第3、4个疗程6~15d联用rhGM-CSF [5μg/(kg·d)]加动员PBSC,动员后每个疗程进行2次白细胞分离,移植后不再给予rhGM-CSF治疗。结果发现移植后中性粒细胞≥0.5×109/L时间的中位数为14d,与以往预处理方案相同的29例乳腺癌BMT病人比较,其植入时间、抗生素治疗天数、输血输液量以及住院时间均明显减少;仅3例病人因血小板恢复缓慢进行了冻存的骨髓干细胞移植。

(6)移植失败病人的治疗 移植失败原因复杂,诊断标准不统一。Nemunaitis等认为出现下列情况之一者即可诊断为移植失败:①移植后第28天中性粒细胞<0.1×109/L;②第21天中性粒细胞<0.1×109/L并伴有致死性感染;③获得早期植人中性粒细胞≥0.5×109/L维持l周后中性粒细胞又降到0.5×109/L以下并持续1周以上。对应用rhGM-CSF60~1000μg/(m2·d)治疗37例移植失败病人,其中alloBMTl5例,syn-BMTl例,ABMT21例,疗程14d或21d,规定反应指标是末次rhGM-CSF疗程开始后14d内中性粒细胞≥0.5×109/L。结果表明21例对治疗有反应,ABMT与allo-BMT间无差异,多数病人中性粒细胞维持在正常水平,100d和1年无病存活率分别为59%和50%,明显高于以往155例病人的32%和23%,但血小板恢复没有明显改善。在ABMT及allo-BMT中,约10%的病人出现不同程度的植入延迟或植人失败,由于缺乏有效的治疗措施,70%以上的病人死于感染并发症;尽管报道有少数病人受益于改进的支持治疗和二次BMT,但总体活存率并没有明显改善,rhGM-CSF的应用无疑给移植失败病人带来了一线希望。

(7)急性放射病  1987年Brandao-Mello等首次应用rhGM-CSF治疗巴西事故病人,8例病人全身照射剂量为3~6Gy,当外周血白细胞<0.1×109/L时,连续静脉滴注rhGM-CSF500μg/(m2·d)直至中性粒细胞>2.0×109/L并维持3d,然后剂量减半继续用3d,剂量再次减半又用3d停药。4例活存病人(其中2例早期开始给予rhGM-CSF,从未发生感染)中性粒细胞减低天数明显缩短。1989年圣萨尔瓦多事故3例受照射剂量为3~8Gy的病人接受了rhGM-CSF治疗。1990年以色列事故病人于伤后第1~18天接受了rhGM-CSF治疗。第4天接受BMT后,为加快骨髓细胞的植入,第5~18天又加用了IL-3,骨髓的植人和造血功能的恢复明显加快。1991年白俄罗斯1例受12~15Gy60Coγ线意外照射的男病人于伤后第3~6天和16~39天接受了rhGM-CSF治疗,第6~31天加用了IL-3,伤后第20天白细胞开始上升,第36天达0.5×109/L以上,第40天>10×109/L,第60~110天波动在10~50×109/L之间,但血小板没有增加,至100天时仍<10×109/L,并一直靠输血小板悬液维持。伤后第113天病人死于严重的双侧肺炎和内出血。上述结果表明,造血细胞生长因子为事故性急性放射病人的治疗展示了良好的前景。

(8)对其他白细胞减少病人的治疗  临床实践中观察到50%~70%的骨髓增生性综 合征(MDS)病人应用rhGM-CSF后白细胞计数升高,同时也可使10%~25%病人的幼稚细胞增加,提示rhGM-CSF有致恶变的可能,故有人建议与小剂量阿糖胞苷同时应用。对于再生障碍性贫血(AA)的治疗镑.MDS效果要好,除可升高白细胞数外,还可使红细胞和血小板数明显改善,这可能是;hGM-CSF与内源性高浓度促红细胞生成素(EPO)协同作用的结果。RhGM-CSF可明显升高获得性免疫缺陷综合征(AIDS)患者外周血白细胞数,改善病人的临床症状,支持抗病毒药物(AZT、DHPG)的应用,提高病人的生存率。对于特发性中性粒细胞减少症病人的治疗反应不一,有人建议测定病人CFU-GM来选择病例。

总之,rhGM-CSF可促进骨髓抑制病人造血功能的恢复,升高外周血白细胞及中性粒细胞,减少感染并发症,使原发病或继发感染能得到及时治疗,提高病人生存质量,降低病死率。

(C)重组人巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和重组人多潜能细胞集落刺激因子 (humanrecombinantmuitipoteutialcloinyptimulatingfactor,rHumulti-CSF)的临床应用

1.M-CSF

在临床方面的应用不如GM-CSF、G-CSF报道的多,究竟其临床应用前景如何,还有待进一步的研究。1986年有报道人尿纯化的M-CSF能使化疗所致的粒细胞减少尽快得到恢复。1988年相继报道了M-CSF在骨髓移植及先天性粒细胞减少症方面的临床应用,发现能促使骨髓移植后造血的重建。先天性粒细胞减少症患者应用M-CSF后外周血中中性粒细胞轻度增加,单核细胞数并未改变。

2.RHumulti-CSF

可刺激造血干细胞的分化,增强某些免疫细胞的分化,对嗜碱性嗜酸性粒细胞、肥大细胞、单核巨噬细胞均有刺激作用。适用于治疗骨髓衰竭、再生障碍性贫血、骨髓异常增殖综合征等病人的白细胞减少症,也可用于治疗放化疗所致的白细胞减少症和血小板减少性紫癜等,使用剂量视病情轻重而定,一般为250μg/d日皮下注射。

(五)促红细胞生成素

促红细胞生成素(erythropoietin,EPO),是由肾脏分泌的一种重要激素。生理情况下它能促进红细胞系列的增殖、分化、成熟;病理状态下,与多种贫血,尤其与终末期肾脏疾病贫血密切相关。其血清浓度随血氧含量的变化而发生相应的改变,以维持机体在低氧或高氧环境中正常的生理功能。EPO通过一反馈环路调节红细胞的产生。(见图3-2)

图3-2  促红细胞生成素的反馈调节

1906年巴黎大学教授Carnot和De′flandae等发现低氧能刺激红细胞加速生成,而且与红细胞生成组织以外所产生的一种间接液递性因素有关,他们首次提出红系造血受激素调控学说。1947年Grant等发现红细胞生成的刺激与骨髓本身的血氧饱和度无关。1950年Reismann等证明,骨髓红细胞的产生受到一种体液性激素即红细胞生成素调节。制造红细胞增多症的动物模型,发现血液中虽然红细胞增多,但FPO的生成低下,骨髓中原红细胞消失,注射EPO后24h内出现原红细胞,逐渐向成熟阶段演变成幼红细胞,第四天网织红细胞增加。

1971年Stephenson等证实在EPO存在条件下,将骨髓细胞培养于甲基纤维素中或血凝块上,成功地获得了幼红细胞和红细胞的集落。在大量EPO(10~100倍)存在条件下,长时间培养可获得大型的集落——称其为幼红细胞集落群形成细胞(burstforming unit-erythroid,简称BFU-E),在少量EPO存在下,短期培养可获得小型的集落,称其为幼红细胞集落形成细胞(colony-forming unit-erythroid,简称CFU-E)。

(A)促红细胞生成素的生物学特性

红系祖细胞是只能向红细胞系方向分化的定向干细胞,分为两个阶段:BFU-E到 CFU-E,CFU-E再进一步分化为原红细胞直至成熟红细胞,多能造血干细胞在EPO存在条件下,特异地向红系祖细胞分化增殖。CFU-E对低浓度EPO发生强烈的应答反应,加入EPO后7天左右,人CFU-E可增殖形成8~49个细胞的红母细胞集落,BFU-E的进一步分化需要IL-3或GM-CSF的协同作用,并需较长时间(15d)形成较大的集落(500个红母细胞以上)。

从人胎肝可获得纯度达18%~55%的BFU-E,来自骨髓细胞其纯度为5%~18%。最近应用单抗和免疫磁性小珠从400ml血液可得到纯度为57%±14%(45%~79%)的BFU-E。体外培养这些高纯度的BFU-E,在开始48h内加IL-3可产生红系集落,72h后对EPO依赖。仅20%的成人BFU-E表达EPO受体,每个细胞上的受体数远低于CFU-E。但培养4天后,全部细胞都能与125-rhEPO结合,结合量与CFU-E相当。在不含血清的培养条件下GM-CSF和G-CSF能加强IL-3对BFU-E的生长促进效应。给予病人大量EPO,骨髓BFU-E数明显增高,处于DNA合成期细胞的百分率为9%~38%。体外试验表明,骨髓BFU-E受EPO刺激后24h内,DNA合成期的细胞增加一倍以上。上述试验表明BFU-E中至少一部分对Faro反应,甚至在早期EPO亦可促进BFU-E对IL-3反应的敏感性。在不同的BFU-E阶段随着成熟的增加对EPO的反应性增强,骨髓和血液BFU-E的反应亦不一致,因此仅那些愈加成熟且具有分化能力的细胞才对EPO反应,早期细胞结合EPO后数量虽可增多,但不能分化成能合成血红蛋白的细胞。

从血液部分纯化的BFU-E培养于甲基纤维素7d即可分化为CFU-E。从400ml血液可获得107纯度为70%±18%的CFU-E。全部CFU-E均表达EPO受体。但随着成熟度的增加而降低。由BFU-E向CFU-E分化需要EPO的刺激。CFU-E增殖能力有限,必需EPO才形成克隆向终末分化。正常状态下CFU-E处于细胞周期内,大量输血能减少EPO的分泌和周期内CFU-E,从而阻止CFU-E的分化。缺乏EPO,CFU-E经一个周期后即丢失,而缺少血清时,单用EPO即能刺激CFU-E增殖分化。CFU-E的反应性不相同,有的需在克隆形成前对EPO反应,有的仅需作用1~2h,有的至少要作用24h甚至大于24h。因此EPO作为BFU-E和CFU-E的分裂原刺激其增殖,同时又作为分化原促使CFU-E成熟。

EPO能促进某些非红系祖细胞,如粒细胞和血小板祖细胞的分化增殖。在含淋巴细胞的培养基中,EPO有巨核细胞(MK)集落刺激因子活性。给终末期肾病患者注射EPO后12周内血小板计数从224×109/L增至253×109/L(P<0.05),骨髓CFU-MK亦明显增高。应用放射性自显影技术发现巨核细胞上有EPO受体。此外已在体外建立多类对 EPO反应的细胞,可用于研究EPO的生物学效应。

有证据表明成熟红细胞的主要蛋白——血红蛋白的合成也受EPO的影响。EPO对珠蛋白基因转录的作用,可能先于对血红素合成的作用。有人指出EPO刺激胆色素脱氨酶的合成,但不降低血红素合成过程中其他酶的作用。

总之EPO促进红祖细胞增殖,增加红系前体细胞的数量,加速网织红细胞的释放,而不改变红细胞周期的时相,具有分裂原和分化原的双重功能。红祖细胞对多种调控因子反应,是否对EPO反应取决于其成熟程度,但只有EPO是唯一维持其分化的因子。

(B)促红细胞生成素的药理学特性

正常人静脉注射rHuEPO,血浆峰值出现在注射后0.5h。半衰期在首次注射为5h,多次注射后减至4h箱在慢性肾衰病人,半衰期较正常人为长,但多次注射后亦明显缩短。多次注射后血浆清除率的增加机理不明,一般认为是rHuEPO反应细胞膜上受体数量或敏感性的上调而不是由于抗rHuEPO抗体的产生。

皮下注射rHuEPO的代谢过程与静脉注射不同,血浆峰值出现在注射后12~24h,半衰期达20h以上。在注射后48h,血中浓度仍保持较高水平。

血中rHuEPO水平的降低是通过与红系前体体细胞结合的方式抽提出血清。肝脏在代 谢中的作用不明。从肾脏排出的未经代谢的rHuEPO在5%以下。

rHuEPO的药理作用并不能在注射后立即表现出来,因为EPO反应细胞的成熟并释放到外周血需要数天时间。有效者先表现为血中网织红细胞升高,继之血红蛋白(Hb)及血细胞比容(HCT)上升,rHuEPO不仅使红细胞数量增加,还能稳定细胞膜,改善膜的流动性,使红细胞寿命由21d延长到24d。并能改善骨髓病态造血,也可以使血小板轻度上升。

(C)促红细胞生成素的临床应用

目前重组人促红细胞生成素(rhEPO)已广泛应用于治疗贫血病人,包括慢性肾功能衰竭引起的贫血、血清EPO水平正常的贫血疾患,例如类风湿性关节炎、艾滋病、肿瘤所致的慢性贫血和溶血性贫血等,以及外科手术的辅助治疗。

(a)慢性肾功能衰竭(CRF)

肾功能衰竭所致贫血是一个复杂问题,贫血原因受多种因素影响,包括红细胞生命周期缩短,代谢毒素抑制红细胞生成、铁及叶酸的缺乏,透析带来的重金属毒性、骨髓纤维化、出血和溶血等。但最重要的因素是由于肾脏合成EPO不足,红细胞生成减少所致。

在EPO试用于临床以前,多数学者力求应用某种方法促进体内残存肾组织和肾外组织产  生EPO,以补偿其不足,如用雄激素、氯化钴刺激EPO分泌产生,或通过透析解除循环中EPO的抑制因子,改善骨髓对EPO的反应性,但疗效欠佳。近年来经过大量的动物试验和临床观察,证实EPO用于治疗CRF贫血可得良好的效果。

对慢性肾衰依赖透析包括依赖输血者,rHuEPO可完全纠正贫血状态。患者的HCT上升呈现剂量依赖性。Eschbach等对终末期肾衰进行不同剂量rHuEPO治疗对比(均以每周3次于透析后静注),结果rHuEPO剂量为50μ/kg者每月HCT上升3%,而剂量为150μ/kg者每月HCT上升达8%。庞氏以每次143×147μ/kg皮下注射、每周3次,共治疗24例,有效率100%,其中23例停止继续输血。但也有报道少数慢性肾衰患者对rHuEPO的反应不良,推测此类患者除EFE)缺乏外,还有产生早期红系祖细胞促进因子能力低下等其他原因。部分可能同时缺铁,补充铁剂后可以恢复对rHuEPO的反应。研究显示,rHuEPO还可使患者抗氧自由基损伤的能力明显增强,在肾衰的治疗中,除了改善贫血使输血减少或停止外,尚可使食欲明显增加、活动能力及自我感觉改善以及出血症状减轻。人类免疫缺陷病毒(HIV)感染相关性贫血80%无症状HW感染者,20%艾滋病(AIDS)相关性综合征及71%艾滋病患者有贫血。引起贫血的原因包括病毒直接或间接抑制骨髓干细胞,红细胞外周破坏增加,各种机会感染和药物治疗,尤其是齐多夫定(zidovudine)对骨髓的抑制作用。1995年已有报告接受齐多夫定治疗的艾滋病贫血患者,用EPO治疗后HCT显著升高。输血需要量减少。Krantz(1995)认为,EPO水平低于500U/L的艾滋病患者,因贫血经EPO治疗后,HCT升高0.046,红细胞输注量减少,生活质量指数明显改善。1995年有学者比较了EPO对HIV感染的终末期肾病透析患者和糖尿病、非糖尿病肾病患者贫血的疗效。静脉内给予EPO l00U/kg,每周3次,连续8周,约80%的患者HCT升高,升高值各组相似。

(C)骨体增生异常综合征(MDS)相关的贫血

EPO可改善MDS患者的贫血。杨苏楠等1993年用EPO治疗11例MDS患者,其中难治性贫血(RA)9例,RA伴原始细胞增多2例。方法:9例用量为200U/kg,肌注,隔日1次;2例采用剂量递增法,初始剂量为50U/kg,逐渐加量,6周后达到125U/kg,每周肌注3次,疗程l~3个月。结果:显效3例,有效4例,2例血红蛋白水平无改善,但输血次数明显减少。Hellstroml Lindberg l995年报告,使用EPO治疗205例MDS贫血患者,有效率16%。Rase等1995年治疗100例,总有效率为38%,其中RA、环形铁粒幼红细胞性难治性贫血和原始细胞过多性难治性贫血Ⅱ型有效率各为39%、17.5%和12.5%。有效者中86%的患者基础EPO水平低于100U/L,基础EPO低于100U/L的RA患者有效率54%。治疗有效多见于EFE)剂量为150~200U/kg,每周3次时,以上结果表明,RA患者的疗效较好,基础FJK水平低于100U/L的患者最有可能对治疗产生反应。

(d)再生障碍性贫血(再障)

1993年李蓉生等报告,6例再障患者用EPO治疗,剂量为2万/次,皮下注射每周3次,疗程3个月,不予输血、雄激素及肾上腺皮质激素。结果血红蛋白由治疗前(61.8±10.3)g/%上升为(91.0±13.1)g/L(P<0.01),平均上升(29.5±11.3)g/L,其中血红蛋白上升超过30gA者2例、超过60g/L者1例,2例患者血红蛋白恢复至120g/L以上。1994年杜楠等治疗16例再障患者,初剂量为50~60U/kg,皮下注射,每周3次,1个月无效者剂量逐渐增至200-400U/kg,共3个月,结果总有效率为81%。Imamura等(1995)用EPO重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)联合治疗27例,其中中度再障14例、重度再障13例,EPO剂量为100U/kg,rhG-CSF为400 g / m2。结果显示 64%中度再障患者和23%重度再障患者治疗效果好。提示rhG-CSF能够协同EPO引起红细胞增生,尤其对中度再障患者。

(e)肾性贫血

肾性贫血患者的血清ElK)水平明显减低,因此用EPO治疗有效,特别对慢性肾功能衰竭(肾衰)引起的贫血,EPO疗效肯定。1993年周明等治疗11例年龄20~69岁需用腹膜透析的慢性肾衰患者,治疗前均有严重贫血,血红蛋白(57.1±15)g/L,红细胞(1.89± 0.44)X1012/L,HCT为(0.19±0.05)。治疗方案:①EFE)每次100~120UA~g,每周3次,皮下注射;②治疗前1周开始口服铁剂;③整个疗程中不再输血。8周后,血红蛋白升至(108.5±16)g/L,红细胞升至(3.58±0.59)×1012/L,HCT上升至(0.40±0.57),治疗前后有显著性差异(P<0.01),患者面色红润,精神愉快,食欲增加,体力改善,消除了抑郁感。1995年张荣珍用EPO治疗47例,剂量4000U,皮下注射,每周2次,持续8周。结果45例贫血症状明显改善。1996年樊雨良对35例尿毒症患者应用EPO治疗,始剂量50U/kg,每周2次,待HCT高于0.30,血红蛋白80g/L以上减量至50u/kg,每周1次,以维持HCT0.30~0.35。6~8周平均HCT上升(0.10±0.03),生活质量提高,不必输血,自觉症状消失,证明本药除改善肾性贫血外,还能明显提高病人的生活质量。总的来说,EPO治疗肾性贫血已取得了世人瞩目的成就,儿科所有慢性肾衰患者经数月EPO治疗均取得了较好的疗效。目前,一般EIK)起始剂量为75~l00U/kg,每周3次,皮下注射,每月进行剂量调整,以便使HCT达到0.33的目标。

(f)早产儿贫血

早产儿贫血在儿科临床中常见,原因包括血液丢失、红细胞寿命缩短、低EPO浓度及低反应性、迅速生长引起的EPO稀释等。1995年Obladen等对800多例早产贫血儿每周使用EP0300~1200U/kg治疗。结果输血患者减少18%。1995年Gleason等报告,157例早产儿每周使用500U/kg EPO加铁剂治疗,结果显示可刺激红细胞增生,改善贫血病情,降低红细胞输注量。1995年Henry等指出,体重0.8~1.3此婴儿每周接受EPO治疗剂量大于300U/kg及充足铁剂疗效最佳。

   (g)外科术后贫血

1995年Atabek等对40例术后严重贫血患者进行了研究,治疗1周后,EPO组较对照组HCT显著升高。2周时两组HCT均有升高,提示严重术后贫血患者有1周的造血迟滞现象,外源性EPO在术后1周内可加快HCT的恢复。Tsuji等(1995)在一项对照研究中给予5例胃癌切除患者EPO200U/(kg·d),术后7天及术后14天静脉给药,结果显示EPO组HCT术后无显著改变,而对照组则有明显下降。术后7天EPO组血红蛋白浓度明显高于对照组,表明术后给予EPO可防止术后贫血,降低术中及术后的异体输血需要量。

(h)癌症相关性贫血

癌症患者普遍存在贫血现象,其原因是EPO的产生减少和反应性降低所致。Henry等(1995)报道,413例实体瘤及血液系恶性肿瘤贫血患者,皮下注射EPO 100~150U/kg,每周3次,维持8~12周,治疗1个月后,化疗患者的输血需要量减少。治疗 3个月后患者红细胞压积(HCT)显著升高,58%化疗者HCT至少升高0.06。治疗6个月后非化疗患者输血需要量亦明显减少。Garton等(1995)用EPO治疗多发性骨髓病 (MM)贫血患者25例,剂量为150U/kg,每周3次,无效时加倍。EPO治疗组60%患者HCT达到或超过0.38,无需输血,对照组则无反应。Sicvestris等(1995)报告EPO治疗54例MM患者的疗效,剂量为重50U/kg,每周3次,从第6周起增至300U/kg,直至24周为止。EPO治疗组78%患者血红蛋白水平升高,5例输血依赖者在3个月后也未输血,其中4例化疗抗拒者加用干扰素治疗后血清IgM升高,提示干扰素加EPO治疗MM患者对恢复正常B细胞功能是有益的。

(i)其他贫血

有报告用EPO治疗4例系统性红斑狼疮合并贫血的女性患者,剂量2000U,皮下注射,每周3次,疗程3个月。结果血红蛋白由(83.5±6.9)g/L,上升为(121.3±16.1) g/L,平均上升(41.3±17.1)g/L。系统性红斑狼疮合并贫血主要是由于患者血清中有抑制造血因子存在,应用大剂量EPO可以拮抗该因子对红系祖细胞的抑制而纠正贫血。另外有报告(1992)EPO对类风湿性关节炎合并贫血、慢性感染性贫血、孕产妇贫血均有效,但其确切疗效及安全性尚待进一步观察。

(D)  影响重组促红细胞生成素疗效因素及其副作用

(a)影响重组促红细胞生成素(rhEPO)疗效因素

rhEPO已广泛用于临床治疗,但发现越来越多的患者对rhEPO的治疗有抵抗现象,下面就分析产生rhEPO抵抗的原因及可能的处理对策。

1.铁缺乏与铁负荷过重

铁缺乏是引起rhEPO抵抗的最主要原因。促红细胞生成素刺激红系祖细胞,同时也需要足够的铁以合成血红蛋白。临床发现,rhEPO的使用将增加铁的利用而耗尽贮存铁,伴随着rhEPO的治疗,铁缺乏亦越来越严重,最后患者出现持续性红细胞计数下降,这时需要增加rhEPO的剂量,才能维持HCT及Hb在一个满意的水平。因此,在rhEPO治疗期间,大多数患者需要同时补充铁剂。Drueke等认为,由于口服铁不能很好地被吸收,为满足接受rhEPO治疗者铁的需要,静脉补铁比口服补铁更有效。

补充铁剂是纠正rhEPO抵抗的有效方法,但发现部分患者补足贮存铁后,仍呈现 rhEPO抵抗现象。Goch等研究5个维持性血液滤过的患者,所有患者都同时接受rhEPO及铁剂治疗,但当血清铁蛋白明显增高达2667±8p8几后,rhEPO的剂量逐渐从100U/kg增加到400U/kg,每周3次皮下注射,Hb并没有明显升高,当给予铁螯合剂去铁胺 (desferrioxamine)治疗,同时停止补铁,I-lb才逐渐升高,rhEPO剂量从400U/kg减到25U/kg,每周3次皮下注射,此时血清铁蛋白水平随之下降,I-lb仍保持在理想水平,说明铁负荷过重也可引起rhEPO抵抗。这是因为体内积聚的铁不完全具有生物利用度,去铁胺可以提高贮存铁的生物利用度,因此可用于治疗铁负荷过重并对rhEPO抵抗的贫血。

2.维生素缺乏及营养不良

Gastaldello等观察维生素C治疗rhEPO抵抗病人,一组铁负荷过重对rhEPO治疗产生抵抗的患者,用维生素C治疗2~4周后,HCT及Hb逐渐上升到理想水平,其中l例在停用维生素C后,HCF下降,重新给予维生素C后HCT又上升。2例持续补充维生素C,则减少rhEPO剂量亦能维持HCT及Hb在理想水平。补充维生素C可使组织铁动员出来,从而防止rhEPO抵抗。Cristol等给一组接受rhEPO治疗的血液透析患者口服维生素E后发现,在维持稳定的Hb浓度时,其rhEPO的剂量逐渐减少。进一步实验证实,脂质过氧化是EPO抵抗的因素之一,所以用维生素C、维生素E等外源性抗氧化剂可节约rhEPO剂量。此外,维生素B12、叶酸及维生素B6缺乏也可通过减少rhEPO对红细胞生成的刺激而发生rhEPO抵抗效应。

营养不良是透析患者的一个普遍问题,Kamyar等根据SCA(suhjective globalassessment)积分将透析患者分为营养不良、轻度营养不良和营养良好3组。结果发现,营养不良的患者EPO的需要量大于营养良好者。因此,SGA可以作为尿毒症患者rhEPO抵抗的一个指示法。

3.铝中毒

铝中毒与EPO抵抗有关。体内过量的铝可能来源于摄人的磷酸铝凝胶或铝污染的透析液。Rosenlof等报道,当患者血清铝水平大于225g/L时,呈现rhEPO抵抗反应,这些患者体内同时呈现较高的红细胞原卟啉水平。作者认为铝介导rhEPO抵抗可能继发于红细胞生物合成过程中干扰了铁的转运。Bia等也证实有铝中毒的终末期尿毒症者,不管用多大剂量的rhEPO,都不能纠正贫血,除非铝中毒被纠正。认为这是由于铝抑制Hb的生物合成,降低了铁的利用和(或)干扰影响了铁转运的缘故。Casati等对9例血透患者进行研究,5例用去铁胺治疗,经过6个月的观察,这5例患者血清铝水平降低,同时对需要用rhEPO来维持HCT的靶目标的剂量减少,认为铝可降低最初的rhEPO反应。去铁胺治疗可以降低最初的rhEPO反应。

4.甲状旁腺功能亢进

继发性甲状旁腺功能亢进是慢性肾功能衰竭患者常见的临床表现。在rhEPO问世之前,已有报道甲状旁腺激素(PTH)可使内源性EPO对红细胞生成的作用降低。近年Rao等报道,甲状旁腺激素对rhEPO也有类似的作用,作者将18例接受rhEPO治疗的血液透析患者分为两组,一组对rhEPO治疗反应差,另一组对rhEPO治疗反应良好。为维持HCT在35%的水平,前者所需要的rhEPO剂量是后者的3倍多。前者平均血清PTH浓度及骨髓纤维化的程度较后者高,亦即继发性甲状旁腺功能亢进及骨髓纤维化程度越严重,对rhEPO的需要量就越大。这是因为PTH直接抑制红细胞生成并可导致骨髓纤维化。甲状旁腺切除术后,可纠正这一抵抗现象。

5.感染与炎症

红细胞的生成被不同的调节因子所控制。EPO只是红细胞生成的最后一个阶段起主要调节作用的因子。EPO的靶细胞是红系祖细胞,它诱导红系祖细胞的增殖和分化,促使红细胞生成。红细胞生成过程中还受几种细胞因子的反向调节,这些细胞因子是白介素 (IL-1、IL-6)、肿瘤坏死因子-(TNF-a)和干扰素—了(IFN-g)等。上述细胞因子在炎症反应时均是升高的,它们不仅抑制内源性EPO的产生,也抑制红系干细胞的增殖作用。Marian等发现,外周血单核细胞产生的IL-6及IFN-g的量与rhEPO的剂量有直接的正相关关系。众所周知,血清C-反应性蛋白(sCRP)是感染和炎症活动的预测指标。Peter等研究了sCRP与rhEPO剂量的关系,发现sCRP水平越高,血液透析患者所需rhEPO剂量也越大,两者存在正相关系,认为sCRP可作为预测rhEPO抵抗的指标之一。有报告用环孢素(cyclosporin)纠正1例慢性肾衰竭患者的贫血。该患者用rhEPO1800U/周,但Hb仍很低(60g/L),予以环孢素治疗后,所需要的rhEPO剂量减少到 4000U/周,Hb上升到100g/L。患者用环孢素治疗前,sCRP降低了50%左右。Muirhead等的报道也提示急性感染和(或)炎症的终末期尿毒症患者显示有rhEPO抵抗。从体外实验中观察到给大鼠注射细菌脂多糖(LPS)或IL-l后,肾脏EPO基因表达受抑制,同时EPO合成也受抑制。Hoen等对慢性血液透析患者的一个中心前瞻性研究发现与EPO抵抗有关的贫血可能是菌血症的一个危险因素。另外,血液透析患者中有系统性红斑狼疮活动者、有尿毒症心包炎者均可发生EPO抵抗。

6.rhEPO抗体

Peces等报道1例38岁男性血液透析患者,开始用rhEPO剂量为20U/kg每周3次,有良好反应,随着rhEPO用药时间延长,却缺乏治疗反应,在治疗12个月后,尽管rhE- PO剂量增加到35U/kg,每周3次,Hb及HCT仍不提高,作者未发现有其他引起rhEPO抵抗的原因存在。用酶联免疫测定发现该患者血清中存在抗rhEPOIgG抗体,此后用泼尼松30mg/d治疗后,抗rhEPO抗体滴度降低,且患者贫血改善。这一发现说明rhEPO尽管仅有弱的免疫原性,但仍可诱导机体产生IgG抗体,该抗体可能引起rhEPO抵抗。

7.其他

lfudu等报道,终未期尿毒症患者对EPO治疗反应低下与透析不充分有关,对这些患者增加透析强度,HCT明显升高。有报道持续性血液透析患者用不同的透析器,则对 rhEPO的需要量也不同。作者比较了采用聚砜膜透析器的患者与采用铜仿膜透析器的患者,发现前者对rhEPO的需要量明显高于后者。故血透患者对rhEPO的抵抗除与透析强度有关外,还与透析器的生物相容性有关。Navarro和Sami等分别对腹膜透析及血液透析患者作前瞻性研究,发现应用血管紧张素转换酶抑制剂(ACEl)的患者rhEPO需要量增加,这是因为ACEI本身可以引起贫血,并且还可通过血中血管紧张素生成减少而在骨髓水平抑制造血。引起rhEPO抵抗的其他因素还包括溶血、血红蛋白病、骨髓纤维化、恶性肿瘤及其治疗时用的化疗药物等。

因此,慢性肾衰竭贫血患者在接受推荐剂量的rhEPO治疗过程中出现HCT和Hb不随治疗而增加时,则应考虑有rhEPO抵抗,并逐一寻找其原因,采取相应措施纠正这些现象。

1.高血压

经过大量的动物试验和临床观察表明,rhEPO用于动物剂量高达20000U/kg和人体内3000U/(kg·d)时,并无明显的急性毒性,rhEPO用于治疗CRF期间,可出现一些副作用,其中最常见且重要的是患者血压升高,出现高血压或原有高血压恶化,特别是红细胞压积快速上升者最明显。通过降低rhEPO的剂量(如50U/kg,每周三次),使血细胞压积每月增加3%~4%以内,总压积不超过36%,可降低高血压的发病率,仅少数患者需用降压药物治疗。高血压的原因可能与红细胞压积升高及周围血管阻力增加,血浆体积下降、血液粘滞性增高有关。由于用rhEPO治疗非肾性贫血并不引起高血压,因此EPO本身不是高血压的原因。

  2.血栓形成

  有些患者在经过rhEPO治疗后有发生高凝的倾向,但发生严重的血栓形成仍少见。因此有作者指出,如发现患者有凝血的趋势时需用小剂量的肝素治疗。

3.血清铁、叶酸、维生素B12缺乏

rhEPO治疗期间可以引起血清铁、叶酸、维生素B12的缺乏,其程度与Hb的上升呈负相关。治疗过程中应注意监测,及时补充。

4.抗药性

某些感染情况和炎性疾病可导致rHuEPO获得性抗药性,可能是肿瘤坏死因子、IL-l或干扰素释放而减少了骨髓对rHuEPO的反应。体外观察红斑狼疮和类风湿性关节炎患者自身血清可以明显抑制rRuEPO对CFU-E的作用,说明患者血清中存在干细胞抑制因子,已经证明此抑制因子为IL-1。加大rhEPO剂量可以解除此种抑制作用。

5.其他

部分患者有血小板增多症、高血钾症、血浆尿素浓度升高、流感样症状如肌痛等。这些症状可通过rhEPO逐渐减量而消失。

(E)促红细胞生成素的发展前景

随着EPO及其受体基础研究的深入,作用机理逐渐明显,将有利于阐明红系造血的发生与发展。可极大地推动临床广泛应用。目前人们不仅可以从尿液中提纯EPO,还可以通过基因重组的方法制备EPO,因此一次性获得的产量较大,可以满足临床治疗的需要。

(a)慢性肾衰与EPO的应用观察

在美国慢性肾衰病人逐年递增。1972年有10000例慢性肾衰病人,其中3000例做了肾移植手术,1988年慢性肾衰病人已上升至147000例,行肾移植的约为3700例,到 2000年,慢性肾衰病人将达到240000例,慢性肾衰的许多症状均与贫血有关,以往常用治疗方法是雄激素疗法,但此疗法仅对一部分病人有效,并有很大的副作用。输血疗法只能暂时改善血细胞比容,但却有HIV、乙肝病毒、丙肝病毒感染的危险。且输血超过200次以上时,过量的铁负荷亦将成为一个严重而棘手的问题。EPO在美国使用以后,已使 150000病人顺利地进行透析或肾移植治疗,对慢性肾衰的治疗有着重要的意义。

(b)用EPO治疗多发性骨髓瘤相关性贫血

贫血是多发性骨髓瘤(MM)常见的并发症,常提示预后差,其机理尚不清楚,可能是EPO受抑制起决定作用。用EPO治疗MM相关性贫血,结果认为它是一种有希望的药物。

(c)与其他细胞因子联合应用以提高疗效

如与CSF联合治疗等,但也应尽量不断提高制品质量,以降低副作用。目前已有多家公司制备的EPO进入临床应用。如自体输血、取代输血,或用于早产儿未成熟期合并贫血、类风湿性关节炎化疗,手术前后使用,有些病种如肾病继发贫血、艾滋病或由治疗所致的严重贫血、肾病末期并发贫血等。令人瞩目的临床疗效,已使EPO成为众多细胞因子中最具有前景的生物制剂之一。

(六)人生长激素简介人生长激素

(A)人生长激素对人体所有组织(神经组织除外)都有促生长功能(包括骨骼、肌肉、结缔组织、毛发和皮肤)。还能促使脂肪、糖类的降解,增进蛋白质和核酸的合成。这种生理功能不是生长激素直接作用于细胞的结果,而是通过细胞释放生长因子(1GF)的作用。人的生长激素种属特异性很强,动物的生长激素人不能使用。过去在临床上应用的生长激素只能从人的脑垂体提取(3mg~5mg/个),来源十分困难,限制了临床上的研究。自从基因工程技术诞生之后,1985年美国FDA首先批准了重组人生长激素上市。然后瑞典、法国、丹麦也相继批准。我国也已批准上市。

目前,生长激素主要用于治疗侏儒症、烧伤、创伤、骨折、出血性溃疡、肌肉萎缩症、骨质疏松等症。对毛发生长和乳汁分泌也有良好的效果。此外,对免疫系统的增强也有一定作用。

重组人生长激素

英文名称为recombinanthuman growth hormone。

1.  简称

Rhgh

2.  商品名

Somatren、Somatren、Somatonorm、Norditropin、Protropin、Humatrope。

3.结构与性质

本品是人脑垂体前叶分泌的一种非糖基化蛋白质激素,含有191个氨基酸残基,其中有四个半胱氨酸,形成两对二硫键。N端和C端皆为苯丙氨酸,分子量21500,等电点pI为5.2。大肠杆菌表达的本品N端多了一个甲硫氨酸成192个氨基酸,但不影响其生物学活性。然而给人临床使用后,其抗体产生率达30%以上,使用N端不含甲硫氨酸的本品后,抗体产生率仅为5%,临床实验证明,抗体的产生不抑制本品的促生长作用。

4.临床应用

本晶能促进骨骼、内脏和全身生长,促进蛋白质合成,影响脂肪和矿物质代谢。在人体生长发育中起着关键性作用。这些生理功能不是本品直接作用于细胞的结果,而是通过细胞释放促生长介素(somatomedin)等生长因子的作用,例如类胰岛素生长因子I等。

本品主要用于治疗儿童自发性垂体性侏儒症,使用剂量每周为0.5U/kg或0.125rog/kg,皮下或肌内注射,可连续使用3个月至2年,平均增高(10.5±2.2)cm/年,疗效显著且安全。此外,临床上尚可用于治疗烧伤、骨折、创伤、出血性溃疡、特纳综合征、组织坏死、肌肉萎缩症、骨质疏松和肥胖症等。亦可用于运动员健身等。使用剂量视不同情况而异,或遵医嘱。

长期使用本品是安全的,偶有不良反应,如鼻炎、发低烧、头痛、注射部位疼痛、喉炎、咳嗽等,一般均能自愈。而且这些反应一般出现在治疗早期,继续使用,不良反应会消失,所以不能肯定这些反应是由药物引起的。

rHGH只适用于内源性生长激素缺乏的儿童长期应用,一般不用于15~16岁以上的男性或14~15岁以上的女性病人,肿瘤患者、糖尿病患者,颅内进行性损伤者均禁用,有这类病家族史者也是慎用。

5.规格

41U,121U两种规格。

(七)表皮生长因子

早在20世纪60年代初,Cohen博士在纯化小鼠颌下腺神经生长因子(NGF)时发现一组可促进新生小鼠开睑、长牙且对热稳定的蛋白质,随后将这一活性组分加入培养的皮肤表皮时发现,它可直接促进表皮的生长,为此而定为表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF),从此开辟了有关表皮生长因子研究的新领域。众多的研究表明,EGF可用于角膜、烧伤及手术等创伤的修复和愈合。但天然的EGF在人或动物体内含量甚微,难以大量制备供应临床。20世纪80年代以来,创伤领域以EGF的发现及广泛的生物学活性研究成果为契机,通过基因重组技术,已成功地生产出高纯度且活性和结构与天然产物高度一致的重组人表皮生长因子(rhEGF),为EGF在体表创伤和角膜创伤方面的大规模应用提供了现实的可能性。

(A)rhEGF的生物生理基础

自EGF发现以来,众多的研究均表明了细胞膜上EGF受体与EGF结合后形成受体-EGF复合物,通过自磷酸化等一系列生化反应诱导或直接调控细胞增殖的一系列重要基因,启动创面修复的过程,对上皮细胞具有强烈的促生长作用,EGF在体液中含量普遍较低,除在尿中浓度呈年龄依赖性外,在各种生理和病理状态下均无明显变化,因此认为EGF不属循环激素。多类表皮细胞群的生长对EGF的局部刺激能作出灵敏的应答反应,且为这些表皮的高速更新必需。rhEGF是通过基因片段在大肠杆菌表达系统充分表达而获得的与天然EGF活性和结构高度一致的产物,因此理论上rhEGF在活体内亦参与同样的生理过程,具有相同的生物学活性。

(B)rhEGF作用机理

体表创伤包括机械创伤、烧伤和溃疡等。创面的愈合过程是一个十分复杂的生理学过程。传统药物促创伤愈合能力有限,创伤自我修复能力依赖于内源性EGF的释放与参与。 EGF可增强细胞移动、分裂生长和细胞间质蛋白合成能力,促进新血管形成及核酸、蛋白的合成,从而通过组织增生和重要胞间基质的合成来促进各类创面的愈合。在创伤修复过程中,随着成纤维细胞和其他细胞迁移至损伤部位,EGF对炎性细胞、成纤维细胞、表皮细胞、血管内皮细胞有趋化作用,使其向创伤部位移动、分裂增生。创伤部位ECF受体数目增加,内源性EGF也在修复位点积聚,但由于机体体液中EGF含量普遍较低,即使所有积聚在创面的内源性EGF均可与受体结合,其管制环境中EGF也没有达到最适水平,亦满足不了细胞增殖和肉芽组织发育的最大需要,因而创面对外源rhEGF的处理就可作出细胞增殖和肉芽组织发育加速的应答反应,最终表现为创面愈合速度的加快。 rhEGF体外促表皮细胞及皮片生长作用

(C)EGF具有加速表皮生长的作用。

为考察rhEGF有无类似效果,近年来国内亦做了大量的研究工作。有人采用表皮细胞培养法观察了rhEGF对大鼠表皮细胞生长的促进作用。将大鼠表皮细胞分离制成细胞悬液,分别加入含有不同浓度rhEGF的DMEM培养液进行培养,结果表明了rhEGF可有效增强表皮细胞活力,接种后很快贴壁,生长出圆形透明细胞,聚集而形成众多细胞群落并以单层形式向外生长蔓延,彼此融合成片。并且在一定的浓度范围内,细胞生长面积与浓度存在着依赖性,其中10ng/ml作用最为明显,约是对照组的2.1倍。按上述方法进行体外人皮片培养,同样证明了rhEGF具有加速皮片生长作用,与上述结果具有一致性。在近期的实验中发现,rhEGF促皮片生长作用除在一定的浓度范围内皮片生长面积与剂量呈正相关外,与rhEGF的连续性接触也有密切关系。皮片培养动态观察结果提示了培养前4天生长速度最快,随着rhEGF与皮片受体的结合,其在培养液中浓度逐渐降低,随后皮片的生长速度也逐渐变得平缓。rhEGF浓度在1~50ng/ml范围内均表现出了明显的促皮片生长作用,当>50ng/ml时作用抑制,可能质膜上的EGF受体数目受到rhEGF的“负调节”作用(down—Regulation)所致。

(D)药效学实验研究

EGF用于创伤修复的效果已被一系列运动实验所证实。EGF用于创伤实验如皮肤切割伤、烧伤和角膜损伤等动物模型都能有效地增加创面愈合速度。最早的一个实验是在局部使用EGF,加速了耳全皮层皮肤创伤的愈合,随后在不同的实验中,使用猪皮肤的创伤和烧伤模型也表明了EGF加速表皮再生的速度。另有人采用一种海绵作为药物“缓释”载体植于小鼠皮下,然后向海绵内注入不同浓度的rhEGF,结果发现有加快上皮重建及提高创面的抗张强度作用,并与促进创面愈合及肉芽组织形成存在着剂量依赖关系。而且一系列动物模型研究还证明,rhEGF可促进溃疡化烫伤创面的上皮重建和肉芽组织的形成。近年来,关于 rhEGF与角膜创伤方面的体外研究报道较多,结果均一致表明,滴用rhEGF可促进动物和人角膜上皮的增殖。不同方法造成的创伤包括划痕、有机溶剂或轻度化学物质烧伤,EGF增加表皮愈合速度较对照提高30%。另一些研究也证明了rhEGF不仅可以刺激上皮细胞的增殖,而且亦可刺激角膜基质角化细胞和内皮细胞的增殖。rhEGF与新地卡特隆协同局部给药可使灵长类动物损伤角膜上皮修复速度加快,诱导创伤周边区细胞的迅速增殖,且再生组织完全正常。rhEGF对角膜碱烧伤及角膜手术造成的角膜创伤有较好的促愈合作用,可使烧伤创面面积迅速缩小。与类固醇类药物协同给药则可有效地阻止角膜复发性糜烂和穿孔,并能促进上皮和内皮细胞增殖及胶原蛋白含量增加,加快创面愈合。

(E)rHEGF临床应用

大量的临床应用研究表明,rhEGF用于处缈卜科伤口时,可使伤口纤维细胞大量增殖和胶原纤维明显积累,创面抗张强度显著增强。早在20世纪80年代末,Brown等采用随机双盲法,用含有r医学招聘网hEGF的磺胺嘧啶银软膏处理烧伤病人的皮肤移植及供皮区创面,结果发现试验组创面愈合速度较不含rhEGF对照组愈合时间显著缩短。在角膜上皮移植病人随机双盲临床试验中,rhEGF使角膜上皮重建速度较安慰剂组快3~4倍。Daniele等给3个因患神经营养性角膜炎而使角膜上皮永久缺损的病人应用rhEGF处理后,病人完全康复。一项多中心临床试验观察了104例不同角膜病病人,结果更全面反映了rhEGF的临床疗效,并解决了传统方法难以解决的角膜上皮重建和角膜穿孔性糜烂等问题。近期由国家卫生部药品审评中心批准的广州华生基因工程有限公司生产的rhEGF多中心临床Ⅱ期研究,采用自身对照法,共观察各类烧伤创面及难愈性溃疡创面的患者345例,结果显示(未发表资料),rhEGF对各类烧伤创面的愈合速度明显加快,显效率均在80%以上,总有效率达93.48%,其中对加速肉芽创面的愈合作用最为明显,较对照组提前愈合 15d左右。对其他各类创面的愈合速度亦有显著加快,较对照组提前愈合3~7d不等;在16例各种难愈性慢性溃疡创面显示出独特疗效,上述各类溃疡创面病程长达20~136d,均经久不愈,从经验判断非植皮难以愈合,应用rhEGF治疗后,平均用药(16.63±9.54)d,全部治愈。另有上海长海医院应用rhEGF治疗烧伤创面,同样取得明显疗效。

(F)给药途径与剂量

rhEGF给药途径和剂量是影响其药效发挥的重要因素。在以往的研究中,几乎所有的研究者均采用局部给药方法。当皮下给药时,进入血循环的速度受到大分子量、低细胞透性及注射位点可能存在的酶降解因素的影响。因此,局部给药途径是最为快捷、简便而有效的方法。rhEGF局部给药所得结果不尽一致,有人以2.5g/ml浓度用于角膜创伤有明显的促进愈合作用。有人研究指出,rhEGF在10~100g/ml浓度范围内促角膜创伤愈合作用呈剂量依赖性。通过适当的载体将外源rhEGF进行体表局部给药时,从理论上讲,组织中rhEGF只要达到4ng/(g·h)的剂量即可发挥最大刺激效果。但由于1临床应用时影响因素较多,如创面感染程度、分泌物等因素,均可使rhEGF活性降低。因此,临床最佳剂量尚需在临床研究中结合rhEGF剂型及创面的具体情况来决定,才能保证其最佳临床疗效。

(G)安全性

由于rhEGF与内源EGF的结构、活性有着高度的一致性。国内外对rhEGF的安全性研究结果均未发现有免疫反应。rhEGF与其受体的结合存在着饱和机制的负反馈作用,不致引起靶细胞过度增生,未见组织、角膜、血管过度增生现象。国内中山大学对 rhEGF的安全性进行了全面系统的毒理、特殊毒理研究,亦充分证明了它的安全性。目前为止还没有证据表明应用rhEGF后引起瘢痕增生和癌变。Chester等早期所做的有关致癌实验表明,rhEGF虽可刺激癌变细胞的增殖,但不会引起正常组织癌变。在Ⅱ期临床试验中亦未见与本品有关的不良反应,因此高纯度的.rhEGF局部处理各类创面是较为安全的。

创伤愈合是烧、创伤治疗中的一个重要环节。过去往往需用抗感染药物、敷料覆盖等措施等待创面自然愈合,周期较长,易感染,影响治疗效果。rhEGF的发现与生产,为创伤领域提供了新的治疗途径。将基因技术引入烧创伤创面治疗,可缩短创面愈合时间,提高愈合质量。这一临床应用研究成果在近日第九届中美烧伤学术会上得到国际烧伤学会主席朴鲁特教授及与会专家的好评。

rhEGF用于角膜损伤、溃疡及角膜缺损有其特殊疗效,用于烧伤各类创面的治疗显著缩短愈合时间,已在临床初步得到证实。随着研究的不断深入,rhEGF在胃溃疡、口腔溃汤、糜烂性阴道炎、鼻粘膜溃疡等创面的治疗方面将有巨大的开发潜力和临床应用价值。目前正通过rhEGF基因转染技术,即通过基因工程使患者表皮细胞自身分泌生长因子,将转基因生长因子与细胞培养复合移植技术结合起来,可望解决大面积烧伤病人的皮肤来源稀少问题,减少手术次数,加速创面愈合,把创面愈合的治疗提高到一个新水平。

(八)神经生长因子

神经生长因子(nerve growth factor,NGF)是至今为止发现的唯一不仅对中枢及外周神经的正常神经细胞有营养因子作用,而且具有调节损伤神经修复机能的生物活性分子。近年来,对其研究方兴未艾。临床医生对此产生了越来越浓厚的兴趣。下面概要介绍其有关情况。

(A)NGF的概念

1948年Bucker用小鸡肉瘤180及肉瘤37匀浆接种培养鸡胚时发现,其中有生物活性物质能使鸡胚的背根节变大。以后,Levi-Montalcini分析了这一物质,并提出这种能促进神经生长的物质应称为nerve growth factor (NGF),但未提纯和深入分析,直到1960年S.Cohen用生化方法纯化了NGF蛋白,并证明它确有NGF的生物活性,因此,他们两位(Levi-Montalcini和S.Conhen)获得了1986年诺贝尔医学奖。到1970年又分析出由小鼠颌下腺提纯的NFG是个复合蛋白,其中有两个亚基,两个g亚基和一个b亚基,总分子量约为130000,沉降系数为7S。现陆续又从人胎脑、胎盘、精囊等分析出了 NGF也是一个复合蛋白。但通过生物性质分析得知NGF的活性实际上仅存在于p亚基上 (只有118个氨基酸)。故NGF现在大多只指其中的b亚基,又可称为b-NGF,其沉降系数为2.5S,这时的NGF就可认为是单纯蛋白质。目前用基因工程生产的都是b-NGF多肽,其产品在个别国家已逐步应用于临床。

(B)NGF的组成、来源及受体分布

1.组成

中性pH时,应用离子交换层析技术可以从富含NGF的组织匀浆中分离出具有三种亚基(、b、g)NGF。分子量为130000—140000,沉降系数为7S。该复合蛋白含有一个或两个离子,锌浓度可影响其稳定性。亚基分子量约26000,等电点约4.3,它司抑制7SNGF中的丁亚基活性,在机体内起保护NGF作用;g亚基分子量约26000,等电点约5.5,由229个氨基酸残基构成,是精氨酸特异的酯肽酶,是b—NGF在细胞中基因表达加工时结合上的。它有分解NGlPb亚基的能力;b亚基可完全表现NGF的生物活性,它是由两条相同的单链借非共价键连接而成的二聚体,每一单体由118个氨基酸组成,亚基分子量约26000,等电点9.3,在分离NGF过程中产物的裂解都发生在亚基上,Bocchini和Angeletti应用Varo等的简化方法得到一种裂解和未裂解的混合产物,称为 2.5SNGF,它不但具有NGF的生物活性,而且g亚基羧基精氨酸的丢失阻碍了其与了亚基的结合。

 2.来源

NGF来源于神经的靶器官(如肌肉、腺体等)以及胶质细胞(外周神经雪旺细胞和纤维细胞)。含有丰富NGF的组织有成年雄性小鼠颌下腺、精液、蛇毒和豚鼠前列腺等,人体中含量均非常低微,脑组织中只及小鼠颌下腺的十万分之一。不同来源的NGF结构基本相同(7SNGF差异大一些),但它们有一定的交叉免疫反应。故用于病人的产品还是来源于人体的NGF最好。制备方法有粗制(7SNGF)和精制(2.5SNGF)两种。

3.分布

NGF受体(NGFR)分布于所有的神经细胞,但在一些非神经细胞的胞膜上也发现了NGFR,例如雪旺细胞、淋巴滤泡树突状细胞、肌上皮细胞、血管外膜、口腔粘膜和毛滤泡的基底上皮细胞、人B细胞和T细胞等。

(C)NGF的生物学效应与作用机制效应

(1)促进神经细胞生长  ①能使感觉神经,交感神经节数目增加,体积增大,纤维延长,对正常细胞起营养因子作用;②促使神经原分化、发育、轴突的生长;③对损伤神经起修复营养作用;④促进分化、发育,使不成熟的成熟,故有抗肿瘤效应。

(2)增强特异及非特异免疫反应  在许多免疫细胞上存在NGFR。①NGF可使B细胞DNA合成增强,免疫球蛋白(Ig)合成增加;②可提高T细胞活性和促进淋巴细胞增殖;③可促使结缔组织肥大与肠粘膜肥大细胞生长和组胺释放增加。

(3)增强生育能力 成年雄鼠颌下腺NGF含量高于雌鼠10倍左右,雌鼠注射睾酮后NGF含量增加,去势雄鼠NGF含量减少,可能雄性激素与颌下腺NGF含量有关。实验证明发育中的卵巢能转录NGF基因,并把mRNA翻译成NGF。NGF通过其对神经的营养作用调节卵巢发育而获得雌性生殖能力

2.机制

详尽的使用原理有待进一步探讨,大致原理已明确。①NGF的靶细胞膜上存在高亲合力和低亲和力两种受体。这两种类型的NGFR可通过控制内化过程中受体位置而相互转化。 NGF通过一系列过程,内化转运核周体,进而与细胞核受体结合产生效应;②NGF使内源性cAMP增加;NGF和cAMP均可增强细胞间和细胞与支持物间粘着,提高胆碱乙酰转移酶和鸟氨酸脱羧酶活性,促进神经生长,同时NGF也能激活cGMP磷酸二酯酶。还有其他机制如:促进微丝的表达,增加蛋白激酶,引起胞内某些代谢指标的变化。

(D)NGF的临床应用

l.范围

(1)神经系统发育不良  ①弱视;②肿瘤包括雪旺细胞瘤、神经纤维瘤等神经性瘤、黑色素细胞瘤。

(2)神经萎缩  ①视神经萎缩;②青光眼;③早老性痴呆;④享丁顿舞蹈病;⑤神经性耳聋;⑥脑萎缩。

(3)神经修复  各种神经损伤,如脑外伤后的恢复和后遗症、脊髓损伤断肢再植、脊髓移植、脑梗死、脑血管意外等。

(4)神经系统变性疾病  ①运动神经元病;②帕金森病;③脊髓小脑变性等。

(5)促进伤口愈合和增强生育能力

2.方法及剂量

①肌注 量要大,目前还不清楚NGF的作用方式,但小剂量无明显效果。这里说的大剂量是指500~1000U,特别是脑部疾患,虽然有实验证实有确切作用,但不知其是如何通过血脑屏障的。

②局部应用  眼科的球后注射、椎管注射、脑室注射、损伤部位注射以及手术区域注射等,其机理已基本清楚,剂量可小一些。

3.国内外应用情况

主要用于脑外伤、癫痫、周围神经损伤,取得了较好的效果。其次应用于眼科、脑外科、神经内科、骨科、创伤科等。对神经损伤效果之好令人惊异,对青光眼能改善视力及视野。

NGF用于临床的诱人前景将会到来,大量的动物实验结果丰富了对NGF作用的认识。诺贝尔奖获得者Levi-Montlini说,NGF的临床应用有着迷人的希望,NGF不仅对神经系统,而且对内分泌和免疫系统都发挥着重要的作用,是一种能抵抗疾病的全能武器。NGF的发现,使许多疑难病病因找到了答案,为神经生物学这个新兴学科奠定了基础。

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