第三节 发病机制
大量实验与临床研究证实，缺血—再灌注损伤的发生机制与活性氧大量产生、细胞内钙超载、中性粒细胞活化和高能磷酸化合物生成障碍等有关。
一、活性氧的作用
(一)活性氧的基本概念
活性氧(reactiveoxygen)是指化学性质活泼的含氧代谢物，包括氧自由基、单线态氧(1O2)、H202、NO、脂氢过氧化物(LOOH)及其裂解产物LO·和LOO·等(表7—1)。
自由基(freeradical)是指外层轨道上含有单个不配对电子的各种原子、原子团或分子。以氧为中心的自由基称氧自由基。氧自由基包括：超氧阴离子自由基(O2-)和羟自由基(·OH)。O2-是O2的单电子还原产物，主要来源于线粒体，是体内氧自由基存在的主要形式。在Cu2+或Fe2+的作用下，O2-与H2O2反应生成·OH，即O2-+H202→(Fe2+或Cu2+)→O2+·OH+OH-。这就是所谓Fenton反应。 ·OH是体内最活跃的氧自由基，对机体危害亦最大。
单线态氧(1O2)是一种激发态氧，其氧分子两个外层轨道中的一个电子发生反向自旋改变，使外层轨道两电子自旋方向相反，氧分子的反应能力大大增加。这种氧分子在紫外光谱中呈现一条单线，故称为单线态氧(single oxygen)。单线态氧是处于不稳态的氧，化学性质极其活泼，能迅速氧化许多分子，包括细胞膜上多不饱和脂肪酸，对机体所起的生物学作用与自由基相同。
H202本身不是自由基，但在Cu2+或Fe2+的作用下可生成·OH，或通过均裂生成·OH。这是H202导致氧化应激的主要机制。
NO是L—精氨酸(L—arginine)在一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOSwww.med126.com)催化下产生的，它有一个不配对电子，故也是一种气体自由基，它还能与其他自由基反应，生成新的毒性更强的自由基，如过氧亚硝酸根(ONOO-)、过氧亚硝酸(HOONO)和·OH，见下式：
NO+O2- ——(e-+H+)→ONOO- ——H+→HOONO·OH十N02
过氧亚硝酸根氧化性很强，能扩散到邻近细胞造成细胞损伤；过氧亚硝酸不稳定，能释放出·OH和NO2。
NO作用于基可使与能量代谢、抗氧化和DNA合成有关的酶失活，但这学要较高的浓度，可能由诱导型一氧化氮合酶（iNOS)介导。
脂性自由基为氧自由基与多不饱和脂肪酸作用后生成的中间代谢产物，包括烷氧自由基（LO·)和烷过氧自由基（LOO·)。
（二)、缺血-再灌注时活性氧增多的机制
许多研究显示，再灌注数秒钟后，组织和血液中的活性氧就可增多加数倍。在缺血期，组织含氧量减少，作为电子受体的氧不足，活性氧增加不显著。当再灌注提供氧的同时，也提供了大量电子受体，使氧自由基在短时间内爆发性增多。此外，体内清除活性氧的能力不足也是原因之一。
1.线粒体内单位电子还原生成氧自由基增加 在生物氧化过程中，O2接受1个电子生成O2-，接受2个电子生成H2O2，接受3个电子生成·OH，接受4个电子生成H2O。其反应如下：
O2—e- → O2-—e-+2H+ →H2O2↓—e-+H+ →·OH—e-+H+ →H2O
H2O
在正常情况下，细胞线粒体内的98%的O2在细胞色素氧化酶作用下通过获得4个电子还原成水，不形成氧自由基，仅1%~2%的O2经单电子还原为O2-。据研究，每天每个线粒体产生的氧自由基可达107个，但很快被体内自由基清除系统所清除。组织细胞缺氧使呼吸链传递电子的效能下降，不能产生足够的电子使氧经4价还原生成水。而是还原成为生成各种氧自由基。再灌注提供大量的氧，而线粒体呼吸链上的酶活性却不能迅速增强，故线粒体是在灌注时自由基产生的主要来源（如图7-1)。此外，Ca2+超载使线粒体
功能受损，细胞色素氧化酶系统被抑制，致使氧经单电子还原成氧自由基增多；缺氧导致细胞中抗氧化酶活性降低，氧自由基清除减少，也是氧自由基增多的原因之一。
2．血管内皮细胞内黄嘌呤氧化酶形成增加 血管内皮细胞中富含黄嘌呤酶类。正常时，黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XO)占10％，其前身黄嘌呤脱氢酶(xanthine dehydrogenase，XD)占90％。组织缺血时，由于Ca2+超载，激活Ca2+依赖性蛋白酶使XD转化为XO，使XO大量增加；同时，由于ATP降解，次黄嘌呤生成增加。再灌注提供了大量的氧，使缺血时积聚的次黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶的作用下生成黄嘌呤，后者再在黄嘌呤氧化酶作用下生成尿酸，这两个过程都有氧自由基生成(图7—2)。
3．白细胞呼吸爆发产生大量活性氧 白细胞吞噬时伴耗氧量显著增加的现象，称呼吸爆发(respira—toryburst)。其摄取O2的70％～90％经细胞内的NADPH氧化酶作用形成氧自由基(NADPH+02——NADPH氧化酶→NADP++ H+ + O2-)，用以杀灭病原微生物。组织缺血过程中大量中性粒细胞被激活，再灌注又提供大量氧，从而使活性氧大量增加。
4．儿茶酚胺的自身氧化 再灌注也是一种应激状态，此时交感—肾上腺髓质系统会释放和分泌大量儿茶酚胺，后者自氧化生成O2- 。
5．诱导型NOS表达增强 单核细胞和中性粒细胞中含有iNOS。缺血再灌注导致白细胞活化后，iNOS表达上调，导致NO大量生成。NO及其代谢产物OONO-、HOONO和·OH都可导致组织损伤。
6．体内清除活性氧的能力下降 生物体内存在完整的抗氧化系统，包括：
(1)抗氧化酶类 如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)清除O2-，过氧化氢酶(catalase，CAT)清除H2O2，谷胱甘肽过氧化物酶(glutathioneperoxidase，GSHpx)清除H2O2，谷胱甘肽硫转移酶清除脂性自由基等。
(2)非酶性抗氧化物 如维生素E、谷胱甘肽、清蛋白、铜蓝蛋白等也可清除活性氧或控制活性氧的生成。
正常情况下活性氧不断产生，又不断被清除。活性氧的作用具有两重性，一定浓度的活性氧参与生命活动中的许多化学反应、信号转导及基因调控；缺血—再灌注时，由于清除活性氧的能力下降及活性氧大量产生，则造成组织细胞严重损伤。
(三)活性氧的损伤作用
活性氧能和膜磷脂、蛋白质、核酸等多种细胞成分发生反应，破坏细胞的结构和功能，造成细胞损伤。
l.膜脂质过氧化 生物膜(细胞膜、线粒体膜、溶酶体膜和内质网膜)是活性氧攻击的主要部位。生物膜的主要成分是极性脂质(磷脂、胆固醇)和膜蛋白(酶、受体、离子通道等)。膜磷脂富含多价不饱和脂肪酸，易发生脂质过氧化。脂质过氧化的直接后果是其不饱和性改变，继之发生膜流动性降低、脆性增加、膜受体和酶功能改变。严重医学全.在线者可导致细胞结构破坏，细胞内容物外溢，细胞死亡。影响大小因膜本身的位置和功能而异。
(1)细胞膜结构破坏 细胞膜脂质过氧化使细胞膜受体失活、离子通道变构、酶活性改变，从而引起细胞功能和结构变化(图7—3)。
(2)细胞器膜结构破坏 活性氧对细胞器膜脂质攻击结果是：①溶酶体破裂释放溶酶体酶，引起细胞结构损坏；②线粒体肿胀、功能障碍，产能减少；③肌浆网Ca2+—ATP酶活性降低使摄取的Ca2+减少，导致细胞内钙超载。
(3)脂质信号分子生成异常 磷脂是细胞膜所特有的成分，其中肌醇磷脂在信号转导过程中十分重要。虽然肌醇磷脂的脂质过氧化不会影响膜的稳定性，但却会使前列腺素(PGs)、1，4，5—三磷酸肌醇(IP3)和甘油二酯(DG)等生成障碍，致使细胞信号转导异常。
2.蛋白质失活 活性氧可以使蛋白质分子氧化而发生变性、聚合、降解或肽链断裂，从而使酶、受体、离子通道等产生功能障碍。活性氧的攻击目标包括蛋白质肽链中的蛋氨酸、酪氨酸、色氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸等残基，严重影响蛋白质功能。活性氧对酶活性的影响包括：①破坏氧化酶的活性中心——巯基；②破坏酶活性所必需的脂质微环境；③在酶蛋白之间发生交联形成多聚物；④攻击酶活性中心部位的氨基酸；⑤也可激活一些酶，如激活磷脂酶A2使膜磷脂释放出花生四烯酸，导致前列腺素、白三烯生成增多，炎症反应加剧。
3．DNA损伤 活性氧对核酸的作用主要是碱基修饰、断裂和交联。造成DNA损伤的活性氧主要为·OH和NO。DNA损伤包括：
(1)细胞核DNA损伤 细胞核DNA是生物体遗传信息的携带者，具有编码蛋白质的功能，决定着生物体的主要生命活动。显然，DNA损伤的危害是十分严重的。其主要损伤表现为：①碱基修饰：活性氧与碱基发生加成反应，如·OH在胸腺嘧啶的5，6—双键上进行加成反应，形成胸腺嘧啶自由基，从而改变了DNA的结构，影响遗传信息的正确表达；②DNA断裂：·OH和NO从核酸的戊糖中夺取氢原子，使其形成在C4上具有未配对电子的自由基，然后在β—位发生链的断裂，使核酸分子的完整性被破坏，导致遗传突变；③DNA交联：活性氧可使DNA—DNA、DNA—组蛋白之间形成共价结合，引起交联。在双股DNA链之间形成股间交联，从而限制股间解链，导致DNA复制、转录障碍，使遗传信息表达受阻。 ·
(2)线粒体DNA损伤 线粒体不仅是体内能源生产基地，同时还有自己的遗传系统，线粒体DNA(mtDNA)编码线粒体tRNA、rRNA及一些线粒体蛋白质，如电子传递链酶复合体中的亚基等。线粒体DNA是裸露的，不与组蛋白结合，缺乏修复机制，且代谢转换率高，因而极易受到自由基攻击。线粒体DNA受损可导致线粒体的结构和功能障碍。此外，线粒体与细胞凋亡关系密切。O2-和ON00-能导致线粒体膜通透性增加，线粒体膜孔道开放，细胞色素C和其他凋亡因子溢出，进而活化凋亡蛋白酶(caspase)，诱导细胞凋亡。
4．细胞间基质破坏 氧自由基可使透明质酸酶降解、胶原蛋白交联，从而使细胞间基质变得疏松、弹性降低。
