实验二十四 细菌DNA限制性核酸内切酶分析
【原理】
限制性核酸内切酶能识别和切割双链DNA的特异部位,产生系列DNA片段,这些片段经琼脂糖凝胶电泳后可显示为不同的带谱,这些带谱就构成了各不同双链DNA的特征性“指纹(fingerprint)”。
【材料】
1.限制性核酸内切酶 目前常用的有HindⅢ、BamH I、EcoRI、Past I、XhoI、PvuⅡ等,各种酶通常各有其最佳的工作条件,在商品说明书上均有详细介绍,包括酶的识别序列、最适反应条件、温度及贮存条件等参数,故使用前应仔细阅读说明书。
2.细菌DNA 按常规方法提取、纯化细菌DNA、琼脂糖、TAE或TBE电泳缓冲液。
3.电泳仪、水平电泳槽、252nm紫外灯。
【方法】
用电泳缓冲液将琼脂糖配制成所需浓度,加于水平玻璃板医学全.在线上制成凝胶,待凝固后在加样孔中加入经内切酶切割消化的DNA样品,电泳时电压2~5v/cm,电泳时间8~12min,电泳完毕后将凝胶浸于含0.5μg/ml溴乙锭的电泳缓冲液中染色30min,紫外灯照射下拍照。
【意义】
各种属细菌的酶切图谱有明显不同,同种不同型、甚至同型不同株的细菌也可能在图谱上显示其差异。限制性内切酶分析法重复性、稳定性、敏感性均较好,且操作简便,可快速得到结果,因此在细菌的鉴定、分型及进行分子流行病学研究等方面应用较广。