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卫生毒理学-实验指导:实验四 小鼠精子畸形试验

卫生毒理学:实验指导 实验四 小鼠精子畸形试验:◎<一 目的>◎<二 原理>◎<三 仪器及试剂>◎<四 实验步骤>◎<五 统计方法及结果判定>※<一 目的>掌握小鼠精子畸形试验的基本技术  返回顶部※<二 原理>  小鼠精子畸形受基因控制,具有高度遗传性,许多常染色体及X、Y性染色体基因直接或间接地决定精子形态。精子的畸形主要是指形态的异常,已知精子的畸形是决定精子形成的基因发生突变的结果。因此形态的改变提示有关基因及其蛋白质产物的改变。小鼠精

<一 目的>

<二 原理>

<三 仪器及试剂>

<四 实验步骤>

<五 统计方法及结果判定>

※<一 目的>

掌握小鼠精子畸形试验的基本技术

  

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※<二 原理>

  小鼠精子畸形受基因控制,具有高度遗传性,许多常染色体及X、Y性染色体基因直接或间接地决定精子形态。精子的畸形主要是指形态的异常,已知精子的畸形是决定精子形成的基因发生突变的结果。因此形态的改变提示有关基因及其蛋白质产物的改变。小鼠精子畸形试验可检测环境因子对精子生成、发育的影响,而且对已知的生殖细胞致突变物有高度敏感性,故本试验可用作检测环境因子在体内对生殖细胞的致突变作用。

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※<三 仪器及试剂>

  全部试剂除注明外,均为分析纯,试验用水为蒸馏水。
  3.1 实验室常用设备。
  3.2 生物显微镜。
  3.3 甲醇。
  3.4 1%~2%伊红染色液:称取伊红1~2g,溶于100mL蒸馏水备用。

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※<四 实验步骤>

  4.1 动物
  6~8周龄(体重25~35g)。
  4.2 剂量分组
  设一个阴性对照(溶剂)组,一个阳性对照组及三个试验组,每组至少有5只存活动物。阳性物可采用环磷酸胺40~60mg/(kg·d)或甲基磺酸甲酯(MMS)50mg/(kg·d),丝裂霉素C(MMC)1.0~1.5mg/(kg·d)。最高剂量可取最大耐受量,或分别取1/2、1/4和1/8LD50作为剂量组。经口给予,连续5d。
  4.3 操作步骤
  4.3.1 动物处死时间:各种会计资格致突变物作用于精子的不同发育阶段,可在接触某种致突变物后不同时间出现精子畸形,故有条件时,可给于受试物后第一、四、十周处死动物,检查精子形态。因为大部分化学致突变物对精原细胞后期或初级精母www.med126.com/hushi/细胞早期的生殖细胞较为敏感,故一般均是于首次给受试物后的第35d处死。
  4.3.2 用颈椎脱臼法处死小鼠,取出二侧副睾,放入盛有适量生理盐水(1mL)的小烧杯中或放入盛有2mL生理盐水的平皿中。用眼科剪将副睾纵向剪1~2刀,静止3~5min,轻轻摇动。用四层擦镜纸或合成纤维血网袋过滤,吸滤液涂片。空气干燥后,用甲醇固定5min以上干燥。用1%~2%伊红染色1h,用水轻冲,干燥。
  4.3.3 镜检:在低倍镜下(用绿色滤光片)找到背景清晰精子重叠较少的部位,用高倍镜顺序检查精子形态,计数结构完整精子。精子有头无尾(轮廓不清)或头部与其他精子或碎片重叠,或明显是人为剪碎者,均不计算,每只动物至少检查1000个精子。
  精子畸形,主要表现在头部,其次为尾部,畸形类型可分为无钩、香蕉形、胖头、无定形、尾折叠、双头、双尾等。异常精子均应记录显微镜的坐标数,以备查询。并分别记录异常类型,以便统计精子畸形率及精子畸形类型的构成比。
  判断双头、双尾畸形时,要注意与二条精子的部分重叠相鉴别,判断无定形时要与人为剪碎及折叠相鉴别。

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※<五 统计方法及结果判定>

   每个剂量组应分别与相应的阴性对照组进行参数统计方法比较,如用Wilcoson秩和检验法评价精子畸形阳性的标准是,畸形率至少为阴性对照组的倍量或经统计有显著意义,并有剂量反应关系。
  一般阴性对照组的精子异常率为0.8%~3.4%,供参考。但应有本实验室所用实验动物的自发畸形率作参考。

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