（二)大肠杆菌感受态的制备及重组DNA的转化
1．感受态的制备
（1)接种单菌落于2ml LB培养液中， 37℃过夜。
（2)取0.25ml过夜菌入25ml LB培养液中，37℃振摇4～6h至A590=0.4～0.6。
（3)倒入50ml管内，水浴10min，以2500～3000rpm离心5min，弃上清。
（4)缓慢加入75mmol/L预冷CaCl25ml悬浮菌体，冰浴20min，同上离心弃上清。
（5)缓慢加入75mmol/L预冷CaCl21.0ml轻轻混匀后分装在1.5ml Eppendorf管中，每管200μl，冰浴1～2h。
2．重组DNA的转化
（1)将3只Eppendorf管按下列转化项目作好标记，然后按下述进行：
| 转化项目 | 受体菌 | DNA | 总体积 |
| DNA对照组 | 0 | 10μl | 200μl |
| 受体菌对照组 | 200μl | 0 | 200μl |
| 转化组 | 190μl | 10μl | 200μl |
（2)冰浴30min至1h。中间摇动3次，以防受体菌沉底。
（3)42℃90s。
（4)37℃水浴5min。
（5)加入无相应抗生素的Lb 200μl，混匀后，37℃水浴30～60min。
（6)分别取3组反应物各50μl在含相应抗生素的固体LB培养基平皿上涂布，室温下干燥，然后倒置于37℃温箱中培养过夜。
（三)转化子DNA的快速鉴定－快速细胞破碎法
（1)挑取转化平板上的单菌接种于含相应抗生素的2ml LB中，37℃振荡培养至A590值为0.6～0.8。
（2)取1ml菌液至1.5ml Eppendorf管中，9000rpm离心9min，去尽上清。
（3)加入70μl Cracking Gel缓冲液[1mol/L Tris –HCl(pH6.8)10ml,20%SDS 10ml, 250mmol/L EDTA 1.6ml,蔗糖27.2g, 1.2%溴酚蓝1.67ml，加双蒸水至200ml]，混匀后，37℃水浴30min以上。
（4)15000rpm离心15min。
（5)吸取上清点样电泳，观察。
（四)转化子DNA的酶切鉴定
1．转化子DNA的快速少量抽提
（1)同本节 二.（三).1.
（2)菌液移至5ml Eppendorf 管中，9000rpm,离心9min，去上清。
（3)加溶液Ⅰ100μl，溶液Ⅱ200μl，溶液Ⅲ150μl，混匀，冰浴10min。
（4)15000rpm离心15min。
（5)吸取上清，加入异丙醇1ml混匀，置室温15～30min。
（6)15000rpm离心15min，弃上清，加入75%乙醇洗涤2次。
（7)离心弃上清，真空抽干，加入适量1×TE溶解DNA。
（8)取少量DNA电泳，观察浓度。
2．转化子DNA的小量酶切鉴定 同质粒DNA的小量酶切鉴定，见本节 一（三)。
（五)重组子DNA的进一步鉴定
可用Southern印迹杂交法或斑点杂交法等进一步鉴定，详见本节 四。
[附]电泳洗脱法回收酶切DNA片段
（1)用合适的酶切割DNA并电泳。
（2)于紫外灯下从凝胶上切下所要的DNA带，装入含1×TBE缓冲液的透析代内，用夹子封好袋口，并检查有无漏孔。
（3)将透析袋（纵长)与两极间的边线垂直放于电泳槽内电泳，4～5V/cm电泳至DNA贴紧袋壁。
（4)取出透析袋，挤出凝胶块，吸出袋内液体放入1.5ml的离心管内，10000rpm离心5min。
（5)吸出上清放入离心管内，加入等体积的饱和酚和等体积的氯仿，振荡混匀，10000rpm离心5min，吸出上清放入新的离心管内。
（6)加入1/10体积的3mol/L AaAc,2倍体积预冷的无水乙醇，于-20℃放置4～5h。
（7)于4℃，10000rpm离心15min，弃上清。
（8)用75%的酒精洗涤2次，每次均于4℃，10000rpm离心5min，弃上清。
（9)真空抽干，并用适量1×TE溶解沉淀。如此即得所需DNA片段。
三、地高辛配基随机标记DNA探针法
（一)概述
基因诊断是以核酸分子杂交技术为基础，在核酸水平检测人类遗传性疾病的基因缺陷和一些传染病病原体的方法。其基本过程是：制备DNA探针，标记探针，检测样本。开展这项工作的关键是要得到高灵敏度、高特异性的探针。以往人们是用放射性同位素来标记探针DNA。近年来，非同位素标记方法发展很快，已有取代同位素标记法的趋势。地高辛配基随机标记DNA探针法，是较为成功的一种非同位素标记方法。其原理是：用化学方法把类固醇类半抗原地高辛分子连接在dUTP上（Dig-dUTP)。用随机引物及DNA多聚酶，以探针DNA为模板，合成互补DNA，化学修饰过的dUTP同时掺入到标记的DNA探针中。杂交后用碱性磷酸酶标记的抗地高辛单抗与标记探针DNA中的Dig-dUTP结合，加入显色底物，在碱性磷酸酶作用下，转变成深棕色或蓝色的化合物。
1．标记 本试剂盒采用随机引物标记方法，可标记少至10ng，多至3μg的DNA。能在新合成的DNA链每20～25个核苷酸，掺入一个Dig-dUTP，反应时间约为1h。
2．杂交 按标准杂交方法进行。可以采用尼龙膜或硝酸纤维素膜。用过的杂交液可冻存于-20℃，重复使用。
3．免疫学检测 封阻后，检测反应的第一步，抗体结合物与标记DNA结合，出现杂交的半抗原-标记DNA，显色反应起始是在碱性pH条件下加入无色的显色剂X-磷酸盐和NBT，在几分钟内便开始出现蓝色，显色反应的过程持续3d。典型的例子是在24h后终止显色反应。用二甲基甲酰胺洗掉尼龙膜上的颜色后，尼龙膜可重新用于杂交。
4．应用 地高辛配基标记DNA探针及检测试剂盒，能检测0.1pg的同源DNA，能检测1μg哺乳动物DAN中的单拷贝基因，与放射性标记系统比较，此试剂盒能快速得到实验结果（从DNA的标记和杂交至见到检测结果24h内能完成)，而且消除了放射性的不安全问题。这试剂的灵敏度与特异性使它适用于所有的杂交技术（包括DNA-印迹转移，菌落杂交，噬菌斑杂交及原位杂交)以替代同位素标记和放射自显影术。
